铜处理对菠菜幼苗体内氧化应激反应和矿质元素吸收的影响

公 勤，车 勇，王 玲，李兆华,3

(1.新疆农业职业技术学院，新疆昌吉 831100；2.湖北大学资源环境学院，武汉 430062；3.湖北省农村安全饮水工程技术研究中心，武汉 430062)

0 引 言

【研究意义】铜(Cu)是天然存在于土壤中的一种微量元素，参与植物光合作用的电子传递、细胞氧化还原反应等生理活动[1-2]。但是，Cu过量也会对植物产生很强的毒性，如增加细胞膜的通透性、改变染色质结构、影响蛋白质合成、降低酶活性、抑制光合作用、减少矿质元素吸收等[3]。全国土壤中铜的点位超标率为2.1%(与《土壤环境质量标准GB15618-1995》相比)，在所有污染物中Cu的点位超标率位居第四[4]，农用地Cu的风险筛选值在150～200 mg/kg[5]。农田土壤Cu超标也已经影响到农业生产、农产品质量安全[6-7]。离子交换法、化学沉淀法、活性炭吸附法、反渗透和过来法等[8-9]，这些方法所使用的材料价格昂贵、工艺复杂，并不能完全清除重金属。植物修复被认为是一种经济有效修复污染土壤的方法[10-11]。研究植物耐Cu机理、筛选强耐Cu性植物，已成为修复Cu污染土壤的研究重点。【前人研究进展】菠菜 (SpinaciaoleraceaL.)是石竹目藜科的一种草本植物，也是人类餐桌上一种不可缺少的绿叶类蔬菜。有报道显示，菠菜对重金属具有较强的富集能力[12]，尤其是菠菜生长中期对Cu的吸收量大于收获期[13]，用小于0.3 mmol/L(相当于48 mg/L)的硫酸铜处理菠菜幼苗时能促进该植物的生长[14]；用Cu含量为7.93 mg/L的污水灌溉菠菜时，也会使其生长量和产量显著提高[15]，用100 mg/L CuSO4处理菠菜幼苗时，其生物量也会增加[16]，菠菜具有一定的耐 Cu 性。【本研究切入点】菠菜对重金属的强富集能力特性对植物的生物量、氧化应激反应、矿质元素吸收等生长生理机理，是否能够具有抵御土壤高浓度Cu胁迫的能力，成为修复Cu污染土壤的备选植物，研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】以菠菜幼苗为研究对象，设置较高Cu胁迫浓度，观测菠菜幼苗生物量、抗氧化酶、矿质元素吸收等指标的变化，从生长生理角度分析菠菜的耐Cu机理，为研究其耐Cu性及筛选耐Cu性植物提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

挑选颗粒饱满的日本大叶菠菜种子，用0.1% NaClO消毒10 min，再用去离子水冲洗干净后，均匀置于内有滤纸的培养皿(直径9 cm)中，放入25℃培养箱中避光催芽48 h。选取露白的种子播于泥炭土中，待幼苗长至15 cm左右时，挑选生长一致的幼苗移栽至长53 cm、宽23 cm、高18 cm的塑料盆内，每盆10株，盆下用托盘衬底，盆内基质为泥炭土、珍珠岩(7∶3)混合而成，每盆基质总重量为5.5 kg，培养20 d，待长出旺盛根系后进行试验处理，培养期间视土壤湿度浇灌完全 Hoagland 营养液。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

试验设置6个Cu处理浓度，即0(CK)、50、100、400、700、1 000 mg/kg，每个处理3个重复，Cu2+含量以CuSO4(分析纯)的形式提供。0(CK) mg/kg为对照浓度，只添加Hoagland营养液，不添加Cu处理。以0.1 mmol/L NaOH或HCl调节Hoagland营养液pH值至(6.5±0.3)，用营养液配置各处理浓度的CuSO4溶液，Hoagland营养液中含有19.2 mg/kg的Cu2+，已从实际浇灌的Cu处理浓度中减去，以确保Cu处理浓度的准确。每盆浇400 mL，溢到托盘中的溶液再次浇入盆内。蒸发损失水分以去离子水补充至(6.1±0.03)kg。培养条件为温度22/15℃(白天/夜晚)，相对湿度70%～75%，光照14 h、黑暗10 h，光照强度为8 000 Lx。处理8 d后采集植物样品测定指标。

1.2.2 测定指标

1.2.2.1 生物量

将各处理组幼苗从盆中小心取出，先用自来水冲洗，再用去离子水反复冲洗3次，吸水纸吸干后，将叶、茎、根分开，迅速称鲜重( FW) ，105℃杀青10 min，80℃烘箱中烘至恒重，称干重(DW)。

1.2.2.2 根系参数

各处理组选择3个平均长势的幼苗根系对其扫描记录各根系形态，用Epson Expression 10000 XL 图像扫描系统结合Win RHIZO根系图像软件分析总根长、根总表面积、总分叉数和总根尖数等参数[17]。

1.2.2.3 丙二醛、脯氨酸含量

采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量(malondialdehude，MDA)[17]。取叶部鲜样加入磷酸缓冲液研磨至匀浆，离心、取上清液，加入TCA、TBA，混合摇匀加热，迅速冷却离心，测定532 nm，600 nm波长下的吸光度值。

用酸性茚三酮显色法测定脯氨酸含量[18]。称取叶部鲜样，加入磺基水杨酸，沸水中提取冷却后，吸取上清液，加入冰醋酸、酸性茚三酮沸水浴，冷却至室温后，加入甲苯，充分振荡，静置分层后取上层溶液，测定520 nm波长下的吸光度值。

1.2.2.4 抗氧化物酶活性

取0.2 g植物叶部鲜样，置于预冷的研钵中，加5 mL预冷的0.05 mmol/L磷酸缓冲液( pH= 7.8) ，在冰浴上研磨成浆，在4℃，10 000 r/min下离心20 min，分离上清液，4℃下保存备用，该上清液为酶提取液。超氧化物歧化酶(SOD)活性测定按Beauchamp和Fridovich方法测定[19]；过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚方法[20]；过氧化氢酶(CAT)活性测定采用紫外线吸收法[21]；抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性参照NaKano和Asada的方法[22]。

1.2.2.5 矿质元素含量

将各处理盆内的菠菜幼苗取出，剪下根，在20 mmol/L的Na2-EDTA溶液中浸泡3 h除去表面吸附Cu2+，用去离子水反复冲洗干净吸水纸吸干后分别装入烘干袋中，再将菠菜叶片用去离子水反复冲洗干净吸水纸吸干后装入烘干袋中，将叶片、根样品放入烘箱中105℃杀青后，80℃烘干至恒量，研磨粉碎后过80目筛。采用硫酸-双氧水消解，半微量凯式定氮法测定植物N含量[23]；采用钼蓝法测定P含量，采用原子吸收分光光度法测定K含量[24]，采用硝酸-双氧水消解，ICP-MS测定植物中的Cu、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、B、Mo、Ni、Si含量[25]。

1.3 数据处理

对各指标数据进行正态分布检验，非正态数据进行转换后达到正态分布。各处理间的差异显著性采用单向方差分析(One Way ANOVE, LSD检验)，各指标间的相关性分析采用Pearson’s相关系数检验，统计分析均采用SPSS17.0统计软件分析。图形制作采用Origin Pro9.0软件完成。

2 结果与分析

2.1 铜处理对菠菜幼苗生物量的影响

研究表明，50 mg/kg Cu浓度处理时，菠菜幼苗的总鲜重、总干重均高于对照处理，与对照相比，其总鲜重、总干重分别增加了13.2%和13.4%。随Cu处理浓度继续增加，菠菜幼苗的总鲜重、总干重均为逐渐降低趋势，1 000 mg/kg Cu处理浓度时降至最低值，其总鲜重和总干重分别比对照降低了43.8%和52.3%。图1

图1 不同铜处理浓度下菠菜幼苗鲜重(a)、干重(b)变化

2.2 铜处理对菠菜幼苗根系参数的影响

研究表明，50 mg/kg Cu处理浓度时，菠菜幼苗的根长、总根分叉数、总根尖数与对照呈显著性差异(P>0.05)，分别高于对照的33.4%、9.2%和8.7%，继续增加Cu处理浓度时，幼苗根长、根表面积、平均直径、总根分叉数、总根尖数呈下降趋势，1 000 mg/kg Cu处理浓度时，各个根系参数均降至最小值。50 mg/kg Cu处理浓度时，幼苗根系主根粗壮、须根数量明显增多，随Cu处理浓度增加，幼苗根系数量、分叉数、根系长度等逐渐减少，但是在最高Cu浓度(1 000 mg/kg)时，幼苗根系基本结构仍然存在，并处于活体状态。表1，图2

表1 不同铜处理浓度下菠菜幼苗根系参数

Ⅰ: 0 mg/kg (CK); Ⅱ: 50 mg/kg; Ⅲ: 100 mg/kg; Ⅳ: 400 mg/kg; Ⅴ: 700 mg/kg; Ⅵ: 1 000 mg/kg

2.3 铜浓度对菠菜幼苗体内丙二醛、脯氨酸含量的影响

研究表明，菠菜幼苗叶部丙二醛含量仅在50 mg/kg Cu浓度时，较对照相比降低了11.4%，其他各处理中的MDA含量均逐渐升高，以最高Cu浓度(1 000 mg/kg)时的增幅最大，较对照相比增加了85.4%。而各处理中的脯氨酸含量与对照相比表现为先增后降的变化趋势，其中，400 mg/kg Cu浓度时，脯氨酸含量增幅最大，为对照的60.7%，高浓度Cu处理时(1 000 mg/kg)，脯氨酸含量降至最低，较对照相比下降了5.3%。图3

图3 不同铜处理浓度下菠菜幼苗MDA(a)、脯氨酸(b)含量变化

2.4 铜浓度对菠菜幼苗体内抗氧化物酶活性的影响

研究表明，随Cu处理浓度增加，菠菜幼苗体内SOD活性呈逐渐增加趋势，其中，50 mg/kg Cu浓度时，增幅仅为对照的51.1%，而在1 000 mg/kg Cu浓度时，SOD活性增至对照的1.36倍。菠菜叶部POD和CAT活性的变化规律则是在50 mg/kg Cu浓度时，与对照相比无显著性差异(P>0.05)，700 mg/kg Cu浓度时，两者活性显著高于对照(P<0.05)，分别增加了57.1%和51.0%，而在1 000 mg/kg Cu浓度时，POD和CAT活性较对照相比仅增加了28.6%和39.4%。APX活性随Cu处理浓度的增加呈先增后降的变化趋势，在400 mg/kg Cu浓度时，APX活性增至最大值，为对照的1.78倍，1 000 mg/kg Cu浓度时APX活性虽降至最低，但是与对照相比仍增加了0.89倍。图4

图4 不同铜处理浓度下菠菜幼苗SOD(a)、POD(b)、CAT(c)、APX(d)含量变化

2.5 不同铜浓度处理对菠菜幼苗叶部、根部Cu含量的影响

研究表明，随Cu浓度增加，菠菜幼苗叶部、根部Cu含量呈持续增加的趋势，且叶部Cu含量显著高于根部。其中，50 mg/kg Cu浓度时，叶部、根部Cu含量较对照相比分别增加了8.85和0.83倍，而在1 000 mg/kg Cu浓度时，叶部和根部的Cu含量已达到对照的182.11和27.96倍。表2

表2 不同铜处理浓度下菠菜幼苗叶部、根部Cu含量变化

2.6 铜浓度对菠菜幼苗体内大量元素吸收影响

研究表明，Cu浓度为50 mg/kg时，叶部K、Ca、Mg含量均达到最大值，并显著高于对照(P<0.05)，较对照相比分别增加了22.7%、19.4%和8.2%，继续增加Cu浓度时，各处理中的K、Ca、Mg含量下降，在1 000 mg/kg Cu浓度时，3种元素的降幅最大，与对照相比分别减少了19.3%、18.8%和65.1%。而叶部N、P含量在50 mg/kg Cu浓度时稍有下降，在100和400 mg/kg Cu浓度时两者的增幅最大，分别为对照处理的16.3%和2.7%，但是随Cu处理浓度继续增加，1 000 mg/kg Cu浓度时，叶部N、P含量也降至最低。

根部N、P、K、Ca、Mg含量在50 mg/kg Cu处理浓度时也达到峰值，较对照相比分别增加了69.5%、12.6%、9.5%、285.8%和13.9%，随后Cu浓度增加，P、K、Mg含量持续下降，在1 000 mg/kg Cu浓度时，其含量降至最低，降幅分别为对照的48.8%、33.4%和33.9%。根部N、Ca含量虽然也随Cu浓度的增加而减少，但是在1 000 mg/kg Cu浓度时，其含量仍然高于对照，较对照相比分别增加了6.6%和110.4%。表3

表3 不同铜处理浓度下菠菜幼苗叶部、根部大量元素吸收变化

2.7 铜浓度对菠菜幼苗体内微量元素吸收影响

研究表明，50 mg/kg Cu处理浓度时，叶部Fe、Mn、Ni元素含量显著高于对照(P<0.05)，增幅分别为对照的17.7%、28.1%和8.3%，但是高浓度Cu处理对这3种矿质元素的吸收抑制作用较为明显，1 000 mg/kg Cu处理浓度时，其含量降至最低。叶部Mo元素含量随Cu处理浓度的增加而呈下降趋势，在最高Cu处理浓度下(1 000 mg/kg)降至最小值。而Zn、B、Si 3种元素的含量则是随Cu处理浓度的增加而呈上升趋势，1 000 mg/kg Cu处理浓度时升至最高值，较对照相比增加了31.4%、32.3%和564.1%。

根部Fe、Mn、Zn、Mo、Ni元素的变化较为规律，均为先增后降的变化趋势，在50 mg/kg Cu浓度时增幅最大，分别为对照的16.0%、16.9%、16.9%、213.4%、42.1%，在1 000 mg/kg Cu浓度时降至最小值。而B和Si这2种元素则是随Cu处理浓度的增加而上升，在最高Cu处理浓度时没有降低，反而增至最大值，增幅为对照的52.0%和470.8%。表4

表4 不同铜处理浓度下菠菜幼苗叶部、根部微量元素吸收变化

3 讨 论

3.1 不同浓度Cu处理对菠菜幼苗生物量和Cu吸收量的影响

Cu是植物生长发育中的必需营养元素，但是Cu过量会抑制植物生长、影响光合作用、扰乱矿质元素吸收、阻碍蛋白质合成[26]。不同植物对Cu的吸收能力和耐受性存在差异。研究表明，铜矿指示性植物海州香薷(Elsholtziahaichowensis)在土壤Cu含量为65.3 mg/kg的土壤中能正常生长，其叶部、根部Cu含量分别可达到234和140 mg/kg[27]，强耐Cu性植物野花生(Arachispintoi)在Cu含量为142 mg/kg的土壤中能完成其生命周期，其根部Cu含量为475 mg/kg[28]。研究表明，50 mg/kg Cu浓度时，菠菜幼苗生物量增加，叶部和根部Cu含量分别达到了194.3和14.6 mg/kg，其含量虽不及上述2种强耐Cu性植物中的含量多，但是与一般植物相比，菠菜能够表现出一定的耐Cu性。如用5 μmol/L的Cu浓度处理(相当于0.32 mg/kg Cu2+浓度)卷心菜10 d，其生物量显著下降[29]，用10 μg/g(相当于10 mg/kg Cu2+浓度)的Cu浓度处理黄瓜5 d，其光合作用显著降低，生长受到影响[30]。此外，试验结果还显示，最高Cu浓度(1 000 mg/kg)时，菠菜幼苗叶部、根部Cu含量为对照的182.11和27.96倍，生物量减少约为对照的50%，表明高浓度Cu胁迫时，幼苗体内聚集了大量的Cu2+，严重抑制了植物生长，但是植物还未终止生命活动，由此可见，菠菜幼苗具有较强的耐Cu能力。

3.2 不同浓度Cu处理对菠菜幼苗氧化应激反应、抗氧化物酶活性的影响

过量的Cu会对植物产生毒性，促进活性氧(ROS)的形成，造成细胞氧化损伤，增加细胞膜的通透性[31]。MDA是膜质过氧化的重要产物，它可以与植物体内的氨基酸、蛋白质、核酸等物质形成脂褐质，引起细胞内代谢紊乱[32]。试验结果显示，50 mg/kg Cu处理浓度时，菠菜幼苗体内的MDA含量最低，表明此时的膜质过氧化伤害最小，但继续增加Cu浓度，幼苗体内的膜质过氧化伤害加剧，MDA含量增加。脯氨酸是一种渗透调节物质，其含量增加也能提高植物抗氧化能力[33]。试验结果中，50、100、400、700 mg/kg Cu浓度时，脯氨酸含量较对照相比分别增加了22.3%、29.4%、60.7%和55.5%，但是1 000 mg/kg Cu浓度时，其含量低于对照，表明Cu处理时，菠菜幼苗体内能够主动合成脯氨酸，增加脯氨酸含量，抵御不断升高的Cu胁迫伤害，维持生命活动[33]。

植物在长期的进化中已形成了一套自身防御系统，主要由植物代谢产物和活性氧清除酶组成，其中活性氧清除酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)等[31]。SOD是对抗活性氧自由基(ROS)的第一道防线，对外界伤害的反应最明显[34]，APX是缓解叶绿体氧化损伤的关键酶[35]。试验中，50 mg/kg Cu处理浓度时，SOD、APX活性显著升高(P<0.05)，POD、CAT活性与对照相比无显著性差异(P>0.05)，表明低浓度Cu处理时，植物仅需增加SOD、APX 2种酶活性就能降低Cu胁迫伤害，维持其生命活动，而当Cu浓度增至1 000 mg/kg时，SOD、CAT活性增幅显著(P<0.05)，APX活性稍有下降，其原因可能是高浓度Cu胁迫时，植物仍能够主动提升SOD、CAT活性，抵御Cu胁迫伤害，可以看出菠菜幼苗具有较强的耐Cu性，但是，APX对高浓度Cu胁迫较为敏感，此时的Cu浓度已超过了其调节能力范围，导致其活性降低[36-37]。

3.3 不同浓度Cu处理对菠菜幼苗大量元素吸收的影响

重金属胁迫会明显改变植物对矿质元素的吸收和积累[38]，N、P、K、Ca、Mg是影响植物生长、发育、产量和品质的重要矿质元素，参与植物体内重要的生命活动[39]。试验结果显示，低浓度Cu处理时(50 mg/kg Cu浓度)，叶部K、Ca、Mg含量显著增加，N含量与对照相比差异不大，P含量下降，而根部N、P、K、Ca、Mg含量均达到最大值，其原因可能是逆境条件下，植物对矿质元素选择吸收的一种表现[40]，也可能是低浓度Cu处理促进了菠菜幼苗根部对N、P、K、Ca、Mg元素，以及叶部对K、Ca、Mg元素的吸收和积累，而抑制了叶部对P元素吸收。类似试验结果在同类研究中也有报道，如400 mg/L CuSO4处理菠菜幼苗时，其叶部K含量增加[40]；铜处理时，玉米幼苗体内P含量降低[41]；5 μmol/L Cu浓度下，拟南芥根部Ca、Mg含量增加[42]；80～100 mmol/L Cu浓度处理小麦时，其体内Ca、Mg含量也呈增加趋势[43]。此外，随Cu处理浓度增加，菠菜幼苗体内这5种营养元素均为下降趋势，其中在高浓度Cu胁迫时(1 000 mg/kg Cu浓度)，叶部N、P、K、Ca、Mg含量，以及根部P、K、Mg含量均降至最低，其原因可能包括以下2个方面，一是由于植物体内必需营养元素的吸收通常是由专用的运输载体来完成，而在重金属胁迫下，重金属离子会与必需元素竞争载体上的位点结合，从而降低了必需元素的吸收；二是重金属胁迫对植物体产生毒害，影响了正常的生理功能，从而导致植物对矿质营养元素的吸收和转运能力下降[38]。 另外，还值得注意的是，1 000 mg/kg Cu浓度时，幼苗根部N、Ca含量虽然较低浓度Cu浓度处理(50 mg/kg Cu浓度)相比有所降低，但是与对照相比，这2个元素含量有所增加，其原因可能是由于N是植物生长的核心元素，Ca具有调节植物体内水分，降低植物蒸腾速率和调控生理生化酶活性的作用[44]，因此，即使在如此高浓度Cu胁迫时，菠菜幼苗仍能够增加对这2种元素的吸收和积累，以维持其生命活动，也是其耐Cu性的表现之一。

3.4 不同浓度Cu处理对菠菜幼苗微量元素吸收的影响

微量元素虽然在植物体内含量少，但也是植物生长代谢的重要组成部分，重金属胁迫下，植物体内的微量元素吸收和积累也会发生变化[45]。研究表明，低浓度Cd胁迫能促进小麦根部对Mn元素的吸收和积累[46]，400 mg/L Cu处理时，菠菜幼苗叶部Fe含量与对照相比增加了1倍[13]。试验结果显示，低浓度Cu处理(50 mg/kg Cu浓度)时，菠菜幼苗体内除叶部Mo、Si含量下降外，其余叶部、根部的微量元素含量均呈增加趋势，其中叶部的Fe、Mn、Ni含量，以及根部的Fe、Mn、Zn、Mo、Ni含量增至最大值，表明对于大多数微量元素来说，低浓度Cu处理并没有抑制植物对其吸收，反而起到了促进作用，其原因可能是低浓度Cu处理还未对菠菜幼苗的生长生理活动构成伤害，幼苗在生长发育中主动吸收、积累微量元素，为其生命活动提供营养，最终使植物生长量增加。在高浓度Cu处理(1 000 mg/kg Cu浓度)时，叶部Fe、Mn、Mo、Ni含量，以及根部的Fe、Mn、Zn、Mo、Ni含量均降至最低，其原因可能是高浓度Cu胁迫较大的损坏了植物的细胞膜结构，导致细胞内部营养元素外流，也可能是高浓度的Cu胁迫扰乱了植物对矿质元素的吸收平衡、破坏了矿质元素的运输载体，导致其含量显著下降。但是，叶部的Zn、B、Si含量和根部的B和Si含量在1 000 mg/L Cu浓度时反而增至最大值，其原因可能是Zn[47]、Si[48]具有缓解重金属对植物产生胁迫伤害的作用，虽然植物处于高浓度Cu胁迫环境，矿质元素平衡受到严重干扰，但是植物仍能在体内保留对降低胁迫伤害有帮助的矿质元素，以维持其生命活动[47-48]。此外，B元素对植物根系生长的促进作用强于其他元素，在Cu胁迫条件下，植物为维持生长发育，首先必需确保根系的生长，因此，此时植物在根部主动吸收和积累B元素，并将其运输至叶部，也是植物在逆境条件下对矿质元素选择吸收的一种表现[13]。

4 结 论

4.1菠菜幼苗叶部、茎部、根部生物量的变化趋势与各处理下总生物量的趋势一致，与对照相比，均呈先增后降的变化规律。根系吸收、运输养分的功能仍在发挥作用。尽管幼苗体内聚集了如此高浓度的Cu含量，但是植物仍处于存活状态，菠菜幼苗具有较强的耐Cu能力。

4.2低浓度Cu处理(50 mg/kg Cu浓度)显著增加了菠菜体内的Cu含量，但是植物能够主动调节抗氧化系统抵御胁迫伤害，促进了矿质元素吸收，增加了植物生物量。而高浓度Cu胁迫(1 000 mg/kg Cu浓度)导致菠菜体内Cu含量平均增至对照的105倍，此时植物通过调节体内抗氧化系统已很难抵御高浓度Cu胁迫伤害，导致矿质元素吸收显著抑制，植物生物量降至最低。菠菜幼苗能够表现出较强的耐Cu性，可以作为修复Cu污染土壤的备选植物。