超高效液相色谱法同时测定障眼明胶囊中7个成分的含量

王月清

（东南大学附属中大医院江北院区药剂科，江苏 南京 210048）

障眼明胶囊由石菖蒲、决明子、车前子、菟丝子、葛根、白芍、山茱萸、菊花、关黄柏、青葙子、甘草、黄芪、枸杞子、党参、肉苁蓉、升麻、蕤仁（去内果皮）、川芎、蔓荆子、黄精、熟地黄、密蒙花22位药材组成，具有退翳明目，补益肝肾的功效，临床主要用于初期及中期老年性白内障[1]。该药收载于《新药转正标准》第82册，质量标准含量测定项下采用高效液相色谱法（HPLC）测定芍药苷含量，鉴别项下仅对关黄柏、甘草及黄芪做了定性检查，目前文献仅有障眼明胶囊中葛根素和芍药苷的成分分析[2]，未见其他药材成分分析的相关报道。药食同源的决明子自古有清热明目作用，主要成分蒽醌类占1 %，典型化合物为橙黄决明素和大黄酚[3-4]；车前子主要治疗目赤肿痛、目视昏暗，其药理活性成分主要为苯乙醇苷类毛蕊花糖苷及环烯醚萜类京尼平苷酸，《中国药典》2020年版也将这两种成分作为含量测定的指标[5-7]；被《神农本草经》列为上品的菟丝子具有明目养肝，抑制白内障形成的功效，金丝桃苷是其主要活性成分之一[8-9]；葛根能改善眼功能，白芍养阴平肝[10-11]。由于该中成药由20味中药组成，多指标的定量测定方法虽然成本较高，但更有利于对药品质量的全面客观的评价。本研究采用梯度洗脱法结合分段变波长检测法，首次建立了同时测定橙黄决明素、大黄酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金丝桃苷、葛根素、芍药苷的超高效液相色谱（UPLC）法，结果表明，该方法简便快速、灵敏度高，为该药的质量控制提供了依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

安捷伦1290 infinity超高效液相色谱仪（包含二元梯度泵、自动进样器、柱温箱和PDA检测器，安捷伦科技公司）；ABS-135S型电子天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司）；TGL-16G离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 材料

障眼明胶囊（批号：20190922，20191027，20191125，20191219，规格：0.25 g/粒，湖南德康制药股份有限公司）；橙黄决明素对照品（批号：111900-201605，纯度：98.3 %），大黄酚对照品（批号：110796-201922，纯度：99.4 %），毛蕊花糖苷对照品（批号：111530-201914，纯度：95.2 %），京尼平苷酸对照品（批号：111828-201805，纯度：98.1 %），金丝桃苷对照品（批号：111521-201809，纯度：94.9 %），葛根素对照品（批号：110752-201816，纯度：95.4 %），芍药苷对照品（批号：110736-201943，纯度：95.1 %，中国食品药品检定研究院）；甲醇，乙腈均为色谱纯（美国默克公司），其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[12-14]

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；流动相：乙腈（A）-0.5 %醋酸水溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，8 %→25 %A；20～25 min，25 %→38 %A；25～31 min，38 %→65 %A；31～35 min，65 %→8 %A；流速：0.2 ml/min，检测波长：230 nm（0～12 min），250 nm（12～17 min），330 nm（17～20 min），360 nm（20～23 min），284 nm（23～35 min）；柱温：30 ℃；进样量：2 μl；色谱记录时间：35 min。

2.2 溶液配制

2.2.1 混合对照品溶液的制备 分别取橙黄决明素、大黄酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金丝桃苷、葛根素、芍药苷对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含橙黄决明素100.2 μg，大黄酚77.53 μg，毛蕊花糖苷21.67 μg，京尼平苷酸62.99 μg，金丝桃苷55.97 μg，葛根素40.08 μg，芍药苷22.16 μg的混合对照品溶液，室温避光保存。

2.2.2 供试品溶液的制备 取障眼明胶囊10粒，研匀，取粉末约0.5 g，精密称定，置棕色具塞锥形瓶中，加稀盐酸10 ml及三氯甲烷40 ml，加热回流1.5 h，冷却，分取三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至20 ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，10 000 r/min离心10 min，取上清，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得，室温避光保存。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按障眼明胶囊制备工艺，分别制备缺决明子、车前子、菟丝子、葛根、白芍的阴性样品，按2.2.2项下方法操作，制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性和专属性试验 分别取混合对照品溶液、供试品溶液及2.2.3项下的阴性对照溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图1。结果显示，混合对照品溶液与供试品溶液中各指标成分色谱峰的理论塔板数均大于8400，分离度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.04之间，表明系统适用性良好。在样品色谱图中，分别有与对照品保留时间一致的特征峰，表明各化合物之间分离度好，无干扰，专属性良好。

图1 UPLC图谱

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取2.2.1项下混合对照品溶液1，2，3，4，5，6 ml，置于同一25 ml棕色量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得系列浓度的混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图。以峰面积为纵坐标（Y），相应对照品浓度为横坐标（X，μg/ml）进行线性回归，绘制各组分标准曲线，计算回归方程和相关系数。结果表明：橙黄决明素、大黄酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金丝桃苷、葛根素、芍药苷在试验范围内成良好的线性关系。精密量取2.2.1项下混合对照品溶液，用甲醇倍比稀释，按2.1项下液相色谱条件进样分析，峰面积信噪比10:1（S/N=10）时的混合对照品溶液浓度为定量下限（LOQ），峰面积信噪比3:1（S/N=3）时的混合对照品溶液浓度为检测下限（LOD），结果见表1。

表1 分析物的回归方程、检测下限及定量下限

2.3.3 仪器精密度试验 精密吸取2.2.1项下混合对照品溶液2.0 ml，置于同一20 ml棕色量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果橙黄决明素、大黄酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金丝桃苷、葛根素、芍药苷峰面积RSD分别为0.55 %，0.67 %，0.46 %，1.01 %，0.71 %，0.61 %，0.82 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号：20191219），分别于制备后0，4，10，16，18，20，24 h，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果橙黄决明素、大黄酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金丝桃苷、葛根素、芍药苷峰面积RSD分别为0.48 %，0.52 %，0.63 %，0.56 %，0.71 %，0.78 %，0.85 %（n=7），表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取同一批供试品细粉约0.5 g（批号：20191219），精密称定，共6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并计算7个成分的含量及其RSD值。结果橙黄决明素、大黄酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金丝桃苷、葛根素、芍药苷的平均含量分别0.6132，0.3866，0.0863，0.1333，0.0922，0.3074，0.1025 mg/g，RSD分别为0.71 %，0.59 %，0.92 %，0.63 %，0.83 %，1.08 %，0.76 %（n=6），表明方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取已知含量的障眼明胶囊（批号：20191219）细粉6份，每份约0.25 g，精密称定，精密加入橙黄决明素、大黄酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金丝桃苷、葛根素、芍药苷混合对照品溶液（质量浓度分别为77.25，48.75，10.92，16.86，11.75，38.85，12.95 μg/ml）2.00 ml，按2.2.2项下供试品溶液方法制备，按2.1项下色谱条件进样测定，计算各成分加样回收率及其RSD值。结果橙黄决明素、大黄酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金丝桃苷、葛根素、芍药苷的平均加样回收率分别为99.73 %，99.66 %，99.56 %，99.03 %，99.12 %，99.02 %，99.59 %，RSD分别为1.01 %，0.71 %，0.92 %，0.65 %，0.70 %，0.76 %，1.08 %（n=6），表明本方法回收率良好，见表2。

表2 7个成分的加样回收试验结果（n=6）

2.3.7 样品含量测定 按2.1项下色谱条件，分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液和供试品溶液各2 μl，进样测定，记录橙黄决明素、大黄酚、毛蕊花糖苷、京尼平苷酸、金丝桃苷、葛根素、芍药苷的峰面积，对4批障眼明胶囊中7个成分含量进行测定，结果见表3。

3 讨论

本研究对供试品溶液进行190～400 nm全波长扫描，结果发现230，250，330，360 nm及284 nm波长下色谱峰丰度、分离度较好，故选择利用PDA检测器，采用波长切换法检测橙黄决明素，大黄酚，毛蕊花糖苷，京尼平苷酸，金丝桃苷，葛根素，芍药苷。依次考察了不同比例和梯度的流动相系统（甲醇、乙腈、0.5 %醋酸、0.5 %磷酸）、柱温（20，25，30，35 ℃）、体积流量（0.1，0.2，0.3，0.4 ml/min）、进样量（1，2，3μl）等对色谱峰的影响，以峰分离度、峰对称因子等为依据进行了筛选，并分别优化了不同体积比的稀盐酸和三氯甲烷提取溶剂（10:30，10:40，10:50）、提取方式（浸渍过夜、超声处理、加热回流）、定容溶剂（50 %甲醇、75 %甲醇、甲醇、乙醇、水）、提取时间（1，1.5，2 h），最终确定了2.1项下色谱条件及2.2.2项下供试品溶液的提取方法。

考察了Waters Acquity UPLC BEH C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱、Phenomenex Kinetex XB C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）及YMC-Triart UPLC C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱的分离效能。结果显示，各成分均能有效分离，但Waters色谱柱中各色谱峰峰形较好且对称性满足要求，因此选用Waters Acquity UPLC BEH C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱。

UPLC在分析效率、灵敏度和峰容量方面优于常规HPLC，并可显著减少分析时间，可在短时间内达到平衡，同时相应会减少溶剂消耗[15-16]，因此，已越来越多地应用于中药分析研究。

本试验采用1.8 μm小颗粒填料色谱柱，相比于HPLC使用的常规色谱柱，这一基于小粒径的分析法具有更高的效率、更佳的数据质量，能显著缩短分析时间，在保证所测定有效成分含量结果一致的情况下，分析时间节省了近30 min。

综上，本试验采用UPLC对障眼明胶囊中7个活性成分同时进行测定，方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，对科学全面评价障眼明胶囊质量具有参考价值。