黑龙江省马铃薯晚疫病菌线粒体DNA单倍型分析

郭 梅，杨 帅*，王文重，魏 琪，董学志，毛彦芝，王 玲，李学敏，李学峰，刘雅萍，刁 琢，闵凡祥

（1.黑龙江省农业科学院马铃薯研究所，黑龙江 哈尔滨 150086；2.黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所，黑龙江 哈尔滨 150086；3.牙克石森峰薯业有限责任公司，内蒙古 牙克石 022150；4.大兴安岭地区农业林业科学研究院，黑龙江 加格达奇 165000）

由致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的马铃薯晚疫病是马铃薯生产上最具威胁的毁灭性病害[1]，其病原菌可通过游动孢子对马铃薯实施侵染，引起生长季植株叶片出现水浸状软化进而萎蔫、枯死，同时还能传导至薯块并潜存其中引起腐烂，成为下一年马铃薯晚疫病大发生的主要初侵染源[2]。自1845年马铃薯晚疫病在爱尔兰引起骇人听闻的“大饥荒”事件至今，该病始终威胁着全球马铃薯健康生产，并造成巨大的经济损失[3]。马铃薯晚疫病菌群体结构变化直接影响着病害的发生与流行[4]。近年来，随着晚疫病菌表现型和基因型研究的更加深入，国内外学者认为A2交配型的存在是该病能在世界范围内频繁发生和流行的主要原因[5]，这一发现也再次引起了国际社会的极大关注[6]。

相比于核基因组，线粒体基因组的结构简单、单亲遗传以及无组织特异性等特点，使其在监测晚疫病菌迁移、流行及群体遗传结构动态变化的研究中发挥重要作用[7]。目前，国内外在线粒体DNA 多态性的研究方面主要采用PCR-RFLP法[8]。Griffith 和 Shaw[8]利用改进的 PCR-RFLP 方法将线粒体单倍型分为Ia，IIa，Ib 和IIb 四种单倍型。四种单倍型在世界的不同国家和地区的分布情况不尽相同，但普遍认为Ib 为旧群体，其他三种单倍型为新群体。目前国内外主要是采用这种方法进行晚疫病菌线粒体DNA 单倍型的检测。

中国是世界马铃薯生产第一大国，种植面积和总产量均居世界第一位[9]。黑龙江省因兼具极佳的地理位置和得天独厚的冷凉气候，成为中国重要的马铃薯种薯及商品薯主产区之一[10]。然而，由于近几年黑龙江省马铃薯生长季节持续出现降雨量大且周期长等特殊天气，马铃薯晚疫病在哈尔滨、绥化、克山等主要种植区发生十分严重。因此，本试验通过系统分析近年来黑龙江省主产区及哈尔滨地区晚疫病菌线粒体DNA 单倍型情况，以期更好地了解黑龙江省晚疫病菌遗传结构组成，监测群体变化动态，从而为晚疫病的深入研究奠定基础，进而为制定符合黑龙江省马铃薯生产的晚疫病防控策略提供指导。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试晚疫病菌分别于2015～2020 年采自黑龙江省哈尔滨、齐齐哈尔、绥化、鹤岗、伊春、黑河和大兴安岭7 个马铃薯生产区，所选带病植株均带有明显晚疫病症状。采用常规组织分离法将带病组织接于新鲜的薯块上，18℃下恒温培养约一周时间，至薯块上长满白色菌丝后，用无菌接种针挑取菌丝至黑麦培养基上，18℃下培养以获取纯化的晚疫病菌，实验室保存、备用。

1.2 菌株基因组DNA 的提取

采用基因组DNA提取试剂盒提取经分离、纯化培养后获得的晚疫病菌DNA。提取DNA后，利用微量核酸蛋白浓度测定仪检测DNA 纯度，当OD260/OD280值大于1.8时，DNA符合后续试验要求。

1.3 线粒体DNA 单倍型分析

采用 Griffith 和 Shaw[8]的 PCR-RFLP 方法进行线粒体DNA 单倍型分析，引物信息见表1。PCR扩增反应采用商品化PCR Mix 的20 μL 体系进行。PCR 反应体系为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，54℃退火 30 s，72℃延伸1 min，34 个循环；72℃下延伸5 min，4℃保存。之后利用内切酶 Msp I 和 EcoR I 对 5 μL 的 PCR 产物于 37℃条件下进行酶切。酶切产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，利用凝胶成像仪在紫外光下检测并拍照。

表1 线粒体DNA 单倍型测定引物Table 1 Primers for detection of mtDNA haplotype

1.4 线粒体单倍型的鉴定原则

马铃薯晚疫病菌mtDNA 单倍型划分标准参照Griffith 和Shaw[8]，根据相应条带在对应位置上的有无，判断菌株的单倍型类型，具体见表2。

表2 依据酶切片段划分致病疫霉mtDNA 单倍型的标准Table 2 Classification standard of mtDNA haplotypes of P. infestans by restriction fragment

2 结果与分析

2.1 马铃薯晚疫病菌样品采集及分离

2015～2020 年在黑龙江省哈尔滨、齐齐哈尔、绥化、鹤岗、伊春、黑河和大兴安岭7 个马铃薯主产区共采集分离了193 份马铃薯晚疫病菌菌株样品，具体信息如表3 所示。

表3 2015～2020 年黑龙江省晚疫病菌样品采集信息Table 3 Information of P. infestans isolates collected from 2015 to 2020 in Heilongjiang Province

2.2 线粒体DNA 单倍型鉴定分析

由图1 可知，P2 扩增片段可以被MspI 酶切为720 和 350 bp 两个片段，或是 720，203 和 147 bp三个片段，或者是641，350 和79 bp 三个片段，分别对应 的 mtDNA 单倍型为 Ia 或 IIb 和 Ib 及 IIa。P4扩增片段可以被EcoRI酶切为609和361 bp两个片段，或者是394，361 和209 bp 三个片段，分别对应的 mtDNA 单倍型为 IIa 或 IIb 和 Ia 或 Ib。当 P2扩增片段经MspI 酶切为720 和350 bp 两个片段时，使用EcoRI 酶切P4 扩增片段进行验证，当得到609 和361 bp 两个片段时，该样品的单倍型为IIb，当得到394，361 和209 bp 三个片段时，该样品的单倍型为Ia。

图1 线粒体DNA 单倍型检测结果判断电泳图Figure 1 Electrophoresis for detection of mtDNA haplotypes

根据判定标准，2015～2020年黑龙江省7个马铃薯种植区的193份样品中共发现3个基因型，分别为Ia、IIa 和 Ib。其中，172 份晚疫病样品为 IIa 单倍型，占比89.12%，为优势线粒体DNA 单倍型；19份晚疫病样品为Ia 单倍型，占比9.84%；2 份晚疫病样品为Ib 单倍型，占比1.04%；所有样品中未发现IIb 单倍型。从采集地点分析（表4），哈尔滨地区发现3 种mtDNA 单倍型，齐齐哈尔地区除发现Ia 和IIa 两种单倍型，其他地区样品均为IIa 单倍型。说明哈尔滨和齐齐哈尔地区马铃薯mtDNA单倍型类型复杂，其他地区马铃薯晚疫病菌mtDNA 单倍型结构单一。从采集年份分析，哈尔滨地区5 年来mtDNA 单倍型变化见图2，除2017年Ia 单倍型占优势外，其他年份基本都是以IIa 单倍型为主，同时2019 年检测发现Ib 单倍型的存在，说明哈尔滨地区年际间晚疫病菌的遗传结构存在动态变化。

图2 哈尔滨地区晚疫病菌线粒体DNA 单倍型年度变化Figure 2 mtDNA haplotypes of P. infestans isolates collected from Harbin City

表4 黑龙江省晚疫病菌mtDNA 单倍型及其分布Table 4 mtDNA haplotypes and distribution of P. infestans isolates collected in Heilongjiang Province

3 讨 论

基于线粒体DNA（mtDNA）的基因型研究是分析微生物地理来源方面的一个很有利的工具，利用此标记可以追溯某些微生物的起源与演变路线[11]。由于致病疫霉线粒体DNA 结构相对简单且稳定性良好，因此被广泛用于致病疫霉菌的群体起源和演化研究[12]。2000 年以来，国内学者对于线粒体DNA 多态性的研究主要是采用PCR-RFLP 方法[8]，对中国各省份马铃薯主产区的晚疫病菌的mtDNA基因型多样性进行了持续的研究与探讨。赵志坚等[12]监测2001 年云南省晚疫病菌mtDNA 单倍型发现群体主要以Ia 型为主；郭军等[13]鉴定了内蒙古地区晚疫病菌群体mtDNA 的单倍型，结果均为IIa 型；韩丽丽等[14]分析了 2010～2012 年 3 年间福建省晚疫病群体的mtDNA 单倍型类型和频率分布，检测结果为存在Ia、IIa 和IIb 三种单倍型，其中Ia 为优势基因型。

在黑龙江省马铃薯晚疫病菌mtDNA 研究方面，前人对黑龙江省致病疫霉mtDNA 单倍型进行了持续的报道，发现Ia、IIa、Ib 和IIb 四种线粒体单倍型[12,15-17]在黑龙江省均有存在，虽然不同时期检测的结果有所差别，但均得出IIa 为优势基因型的结论。本研究分别对黑龙江省多地的马铃薯晚疫病菌菌株和哈尔滨地区连续多年的晚疫病菌群体进行了线粒体DNA 单倍型测定分析，其中，哈尔滨、齐齐哈尔、绥化、伊春和大兴安岭地区均

采集到了较为充足的样品用于mtDNA 的检测，但黑河和鹤岗两地受到当地天气、种植地块以及田间防治水平的影响，只采集到较少的样品用于本次检测，其在代表性上相对不足，因此，也将在后续年份进行持续的关注和报道。本研究结果表明哈尔滨地区有Ia、Ib、IIa 三种单倍型，齐齐哈尔有Ia、IIa 两种单倍型，其他地区mtDNA 多态性单一，均为IIa 单倍型，所有地区均未检测到IIb单倍型的存在。这一结果和前人对黑龙江省晚疫病菌群体的测定结果基本一致。已有研究报道认为Ib 单倍型是致病疫霉菌全球迁移之前的“旧”群体，而其他三种类型则为后期衍生出来的“新”群体。多年来黑龙江省晚疫病菌mtDNA 单倍型分析结果表明，黑龙江省已基本完成马铃薯晚疫病菌群体的新旧群体演变过程，但受到气候和环境变化的影响，在马铃薯生产过程中Ib 单倍型仍然可能发生，因此，对晚疫病菌群体变化开展科学、精准、有效的监测，对更好地进行马铃薯晚疫病防控具有重要意义。