肝硬化患者肠道微生物与生化指标的关联性

李莉莉， 谢瑞祺， 王 莉， 刘友德， 邓丽霞， 邹志强， 秦 松

(1. 中国科学院烟台海岸带研究所，烟台 264003；2. 山东省烟台市奇山医院，烟台 264001；3. 河海大学 海洋学院，南京 201198；4. 中国科学院海洋大科学研究中心，青岛 266071)

人类的肠道中含有大量的微生物。健康的肠道微生物群落形成天然的防御屏障，保证宿主免疫、营养等正常生理代谢的运行。且已有研究表明肠道菌群的多样性与乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等密切相关[1]。

肠道菌群的改变在诱导和促进肝脏疾病的发展中扮演重要角色。肝硬化可引起肠道内革兰氏阴性腐败菌(如大肠杆菌)大量繁殖，进而引起菌群失调，抑制乳杆菌和双歧杆菌等厌氧菌的正常繁殖[4]。在大鼠模型中，肝硬化大鼠肠杆菌科丰度较高[5]。在对藏族肝硬化患者肠道微生物的研究中，肝硬化患者中拟杆菌门含量显著减少，厚壁菌门和放线菌门增加；葡萄球菌属、放线菌属显著减少，乳杆菌属显著增加[6]。肝硬化患者体内与口腔相关的微生物如韦荣氏球菌属(Veillonella)和链球菌属(Streptococcus)等，会产生易位现象，在肠道中繁殖[7]。此外，肝硬化患者菌群失调会导致严重的并发症，如菌血症和肝性脑病，并伴有小肠细菌过度生长和肠通透性增加[8]。尽管已有一些肝脏疾病与肠道微生物的研究，但对肝硬化患者特征肠道微生物的研究较少。本研究通过肝硬化患者的生化指标和肠道微生物组学的联合分析，解析肝损伤与患者的特征肠道菌群的相关性，为肝硬化的精准医疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集了12例肝硬化(CIR)患者粪便及血液样本以及11名无慢性疾病或胃肠道疾病史的健康志愿者(CN)作为对照。排除标准包括：过去3～6个月内使用抗生素或饮酒，有胃肠手术史，有其他肝营养性病毒(HAV、HCV、HEV)或HIV感染史，生活方式不健康。本研究方案和实施过程严格遵循“赫尔辛基宣言”的伦理标准及世界卫生组织与国际医学科学组织理事会共同制定的《涉及人的生物医学研究国际伦理准则》。

1.2 试验方法

1.2.1 生化指标检测

使用自动生化分析仪(贝克曼LX-20，美国富勒顿)测定血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、γ谷酰基转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、总胆红素(TBIL)、总胆汁酸(TBA)、白细胞(WBC)、血糖(GLU)、总胆固醇(CHOL)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、甘油三酯(TG)、凝血国际标准化比率(INR)、极低密度脂蛋白(VLDL)和高灵敏度C反应蛋白(HsCRP)的水平。

1.2.2 肠道微生物16S rRNA基因测序分析

于清晨用一次性采样勺采集受试者新鲜粪便样本，迅速冷冻于-80℃冰箱，进行后续测序分析。采用CTAB/SDS法提取粪便样本总基因组DNA。利用特异性引物(16S V4: 515F-806R)扩增16S rRNA基因。所有PCR反应均使用Phusion©高保真PCR Master Mix(New England Biolabs)进行，在Illumina HiSeq 2500平台上对文库进行测序。16S rRNA测序数据采用微生物生态学平台(Quantitative Insights Into Microbial Ecology platform，QIIME)定量分析(V.1.9.1)。以97%的相似性临界值选择操作分类学单位(OTUs)。利用序列最少的样本对应的序列号标准对OTUs丰度信息进行归一化处理。对每个有代表性的序列，根据RDP分类器算法(Version 2.2，http:∥sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)的GreenGene数据库(http:∥greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi)进行分类信息标注。利用Wilcoxon秩和检验评价组间类群的丰度差异。相关分析采用Spearman相关性检验。采用R包对所有菌群数据进行统计分析(V.2.15.3)。

1.3 统计分析

采用SPSS 23.0进行生化指标的分析。CIR及CN两组间差异采用one-way ANOVA及Bonferroni-Holm事后检验法进行分析，数据用平均数±标准差表示。P值小于0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 CIR与CN组生化指标分析

肝硬化患者血清中ALT、AST、GGT、ALP、TBIL和INR水平均高于对照组，其中GGT、TBIL、TBA和INR水平与对照组差异显著(P<0.05)，表明与对照组相比，CIR组肝损伤程度增加(图1)；INR延长可反映肝功能不全、门脉高压两大失代偿期肝硬化病理生理特征[9]。GGT与肝内合成亢进或胆汁排出受阻，及挤压肝细胞数量、受压强度密切相关，GGT水平的升高也反映了肝功能的异常[10-11]。CIR组CHOL、LDLC、HDLC、ALB和WBC水平均低于对照组，血清中ALB和WBC水平显著低于健康对照组(P<0.05)，ALB、WBC等是代表性肝功能指标，表明CIR组患者肝功能的下降(图1)。CIR组HsCRP整体离散很大，导致误差较大。

(a)血清ALT、AST、GGT、ALP、ALB、TBIL及TBA水平组间差异；(b)WBC、GLU、CHOL、LDLC、HDLC、TG、INR、VLDL 及HsCRP水平差异。CIR为肝硬化组，CN为对照组。* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001。图1 血液生化指标分析Figure 1 Blood biochemical indicators

2.2 CIR组与CN组肠道微生物丰度差异

在门水平上，肝硬化患者肠道中厚壁菌门及变形菌门丰度低于对照组，拟杆菌门丰度高于对照组[图2(a)]。在科水平上，肝硬化患者拟杆菌科、瘤胃菌科、毛螺菌科丰度最高，与对照组相比，CIR组患者肠道中拟杆菌科、瘤胃菌科、毛螺菌科水平上差异不大，略低于对照组；普雷沃氏菌科、韦荣氏菌科丰度高于对照组[图2(b)]。

(a)门水平；(b)科水平。CIR为肝硬化组，CN为对照组。图2 肠道微生物的差异性分析Figure 2 Differences in gut microbial abundance at the phylumand family levels

2.3 属种水平组间差异显著性分析

在属水平上，CIR组布劳特氏菌属、罕见小球菌属丰度显著低于对照组，普雷沃氏菌属、瘤胃菌科UCG-014属丰度显著高于对照组[图3(a)]。在种水平上，CIR组中普雷沃氏菌、瘤胃菌科UCG-014菌被显著富集，瘤胃球菌属5 1 39BFAA菌丰度显著降低[图3( b)]。

2.4 肠道微生物与生化指标相关性分析

选取CIR患者属水平上总丰度排名前20的肠道微生物与生化指标进行相关性分析，其中普雷沃菌属与INR、GGT、TBA水平显著正相关；与ALB水平显著负相关；瘤胃菌科UCG-014属丰度与INR及GGT水平显著正相关。布劳特氏菌属与INR、TBA、TBIL、GGT水平显著负相关，与ALB水平显著正相关。瘤胃球菌属2与TBA、INR水平显著负相关，且与WBC水平显著正相关(图4)。选取种水平上总丰度排名前20中与GGT等生化指标具有相关性的肠道微生物(共11个物种)进行分析，其中普雷沃氏菌9、瘤胃菌科UCG-014菌及瘤胃球菌属5 1 39BFAA菌与对照组差异显著[图3(b)]；且普雷沃菌属9、瘤胃菌科UCG-014菌与INR、TBA、GGT显著负相关，与ALB水平显著正相关；瘤胃球菌属5 1 39BFAA菌与INR、TBA、GGT、TBIL水平显著负相关，与ALB水平显著正相关。CIR患者肠道中普雷沃菌属9、瘤胃菌科UCG-014属及布劳特氏菌属丰度与对照组差异显著(P<0.05)，且与INR、GGT等肝损伤相关生化指标关系密切，可能在肝硬化疾病发生发展过程中具有重要调节作用，在肝硬化预后诊断中有着重要的临床意义。

(a)属水平；(b)种水平。CIR为肝硬化组，CN为对照组。* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001。图3 肠道微生物差异分析Figure 3 Differences in gut microbial abundance at the genus and species levels

* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001。图4 肠道微生物与血液生化指标相关性分析Figure 4 Correlation analysis of bacterial genera and bloodbiochemical indicators

3 讨论

生化分析结果显示CIR组TBIL和TBA水平显著上升，这与周丽等[12]对肝硬化患者血清生化指标的研究一致。ALB、WBC水平显著下降(图1)，与韦丽梅等[13]对病毒性肝炎、肝硬化患者生化指标的研究一致。与健康对照组相比，在CIR患者中观察到INR、GGT水平显著上升(图1)，反映患者肝损伤程度。

肠道微生物组学分析发现：在门水平上，CIR组厚壁菌门丰度较低[图2(a)]，与失代偿期肝硬化患者的肠道微生物特征研究一致[14]，且拟杆菌门丰度较高；在科水平上，CIR普雷沃氏菌科、韦荣氏球菌科水平显著高于对照组[图2(b)]，与Shao等[15]对肝硬化患者肠道微生物特征的观点一致；在属水平上，肝硬化患者普雷沃菌属丰度显著上升[图3(a)]。研究表明，普雷沃菌是潜在致病菌，可能与其促炎作用相关[16]。体外实验显示，Prevotellacopri可以刺激IL-6、IL-23和IL-17等与促炎Th17反应相关的细胞因子。在右旋糖酐硫酸钠诱导的小鼠结肠炎模型中，感染了普雷沃菌属P.copri的小鼠炎症反应增加[17]；与宿主炎症反应关系密切。P.copri也被认为是非酒精性脂肪肝(NAFLD)儿童患者肠道微生物中，与晚期肝纤维化相关的主要菌种[18]。且相关性分析表明，普雷沃菌属9与INR、GGT、TBA水平显著正相关，与ALB水平显著负相关，与肝损伤程度密切相关。同时，瘤胃菌科UCG-014属丰度较对照组显著增加。Boursier等[19]发现瘤胃球菌属丰度的增加与纤维化F2期之间有一定相关性，且瘤胃球菌可以作为NAFLD患者肝纤维化的独立预测因子。且瘤胃菌科UCG-014属与GGT、INR等肝损伤指标显著相关(图4)。

我们还发现在CIR患者中，布劳特氏菌属丰度显著下降。布劳特氏菌是重要的醋酸盐生产菌，而醋酸盐是肠道微生物对肝部脂肪酸β氧化的主要刺激物，布劳特氏菌下调则会影响肝部的生理功能[6]，还可帮助清除肠道中的气体；在人体肠道内有发酵产生短链脂肪酸(SCFAs)的能力，对人体健康发挥积极作用[21]。结果显示肝硬化患者罕见小球菌属丰度显著下降，且该菌属与ALB水平显著相关。在利福昔明用药后肝硬化程度改善的患者中发现罕见小球菌属丰度的增加[22]。罕见小球菌属可产生短链脂肪酸，短链脂肪酸可通过抑制肠道炎症反应，减轻微生物细胞成分或其他代谢产物等对肝脏造成的损伤[23]。此外，肝硬化患者瘤胃球菌属2的丰度较对照组显著下降。Wang等[24]对消瘦型肝硬化前期患者的肠道微生物分析发现，瘤胃球菌属的丰度较对照组降低3倍。

肠道微生物的改变会直接使其代谢产物含量的变化，这些改变可以直接或间接改变肝脏的生理活动。在种水平上，CIR组瘤胃球菌属5 1 39BFAA菌丰度显著下降 [图3(b)]。瘤胃球菌属5 1 39BFAA菌也可产生短链脂肪酸[25]，间接影响肝脏能量代谢[26]、缓解肝损伤程度[23]等。此外，瘤胃球菌属5 1 39BFAA菌产生的D-阿洛酮糖3-差异异构酶(DPEase)可将D-果糖转化为D-阿洛酮糖，且D-阿洛酮糖对宿主生理健康有积极的作用[27-28]。相关性分析表明，瘤胃球菌属5 1 39BFAA菌与INR、TBA、GGT、TBIL水平显著负相关，与ALB水平显著正相关(表1)。证明了瘤胃球菌属5 1 39BFAA菌与肝损伤程度的相关性。

表1 种水平肠道微生物与生化指标相关性

综上所述，肝硬化会导致肝脏生化指标异常及肠道中的菌群失调，肝硬化组中普雷沃氏菌属，布劳特氏菌属，瘤胃菌科UCG-014属，罕见小球菌属，瘤胃球菌属5 1 39BFAA菌与健康组的差异显著，且这些菌与肝硬化患者的肝损伤程度相关。