松柏醇的化学合成及抗炎镇痛活性研究

王朝群，白育军，杨 燕，何希瑞

(1.遵义医科大学 珠海校区生物工程系，广东 珠海 519041；2.西北大学 生命科学与医学部药学院，陕西 西安 710069)

炎症是生物体在创伤、感染等有害刺激下产生的一种防御反应，有利于炎症因子的识别和消除。当免疫失衡时，生物体对炎症因子的反应减弱或增强，从而导致多种疾病[1-2]。目前治疗炎症的药物主要有非甾体类抗炎药如阿司匹林，及甾体抗炎药如糖皮质激素类[3-4]。其中，非甾体抗炎药具有强效抗炎、镇痛和解热活性，是目前使用最广泛的药物之一。一般认为，其核心机制之一是抑制环氧化酶的活性。然而，这些药物在临床使用过程中常出现一些不良反应，极大限制了其广泛使用[5-6]。如非甾体抗炎药与胃肠道、肾脏和心血管不良反应的风险增加密切相关。因此，安全高效抗炎药物的研究与开发一直是生物医学领域的重要课题。天然产物由于具有化学结构新颖、多靶点、活性多样、副作用相对小的特点及优势，一直以来广受科研人员的重视[7-8]。寻求具有高效抗炎镇痛活性的植物源化合物具有重要意义。

松柏醇(Coniferyl alcohol，CA)，又名4-羟基-3-甲氧基肉桂醇，是松柏苷的去葡萄糖化产物[9]。其广泛存在于蛇菰、问荆、黄柏、枳壳、银杏和柑橘等许多植物中。在药物应用领域，CA是抗肝炎药物水飞蓟宾合成的关键中间体。水飞蓟宾是由紫杉叶素和CA按1∶1的比例偶合而成，具有抗炎、肝保护等多种药理作用，是目前发现的最具保肝疗效的类黄酮[10-11]，但迄今针对松柏醇本身的生物活性研究较少。本文以阿魏酸为原料，经酯化还原获得目标化合物CA。然后，以LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞为研究对象，运用MTT、ELISA等方法探究CA对LPS致RAW264.7细胞损伤的保护作用及作用机制；构建炎症及疼痛动物模型，探讨松柏醇的在体抗炎镇痛活性。

1 材料与方法

1.1 材料 松柏醇(实验室合成，纯度≥98%)；RAW264.7小鼠巨噬细胞系(中国医学科学院)；DMEM高糖、胰蛋白酶和胎牛血清等购自Gibco，100 U/ml青霉素、硫酸链霉素DMSO等购自百灵威；ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所；阿魏酸、DIBAL-H等原料或试剂购自阿拉丁；醋酸(中国泰山新宁制药公司)；角叉菜胶(日本和田纯化工)。

KM雄性小鼠[SCXK(粤)2020-0051，24-26 g]，8周龄，饲养环境：12 h的光/暗循环，室温22±2℃，自由获取食物和水。

1.2 仪器 CO2恒温培养箱(Thermo，美国)；ThermoK3全自动酶标仪(Thermo，美国)；电子数显卡尺(乐清市禾有限公司)；质谱(HPLC-6520 Q-TOF，美国)；核磁[Gemini 2000 (VnmrS600 MHz)，美国]；红外光谱(NICOLET 5700，美国)；熔点仪(WRS- 1B，上海易测)。

1.3 方法

1.3.1 松柏醇的合成与结构表征

(1)合成路线

松柏醇的合成路线如图1所示[12]：

图1 松柏醇2的合成

(2)合成步骤

① 阿魏酸乙酯1的合成 于250 mL三口瓶中加入阿魏酸 (10.0 g,51.5 mmol),无水乙醇 120 mL,搅拌下冰浴降温至5 °C，分批加入氯化亚砜(36.8 g,309.3 mmol)。升高温度至78 °C，反应8 h后室温冷却，减压浓缩除去杂质，残留物经水冲洗两次。然后选用乙酸乙酯(100 mL)萃取3次，有机相经干燥，浓缩得浅黄色固体粉末。粗品经硅胶柱层析[洗脱剂∶二氯甲烷∶乙酸乙酯(3∶1～1 ∶1)]得到纯品。

② 松柏醇2的合成 取阿魏酸乙酯 (2.22 g,10.0 mmol) 加入100 mL三口瓶中，加入50 mL甲苯溶解，氮气保护下降低反应液的温度至-70 °C。20 min内滴加1.5 mol/L DIBAL-H 20 mL，控制反应液温度不低于-60 °C。滴加完毕后自然状态下升温至-20 °C，维持20 min。TLC检测反应进程(若反应未彻底完成，则继续滴加适量的DIBAL-H)。降温至-60 °C后滴加稀碱液淬灭反应，搅拌均匀，滴加稀酸，调节PH至4-5。用硅土过滤，然后依次用乙酸乙酯，乙酸乙酯：甲醇(8∶1)洗涤，滤液浓缩得1.2 g粗产物。粗产物经硅胶柱层析分离得到纯品[洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯(2∶1～1∶2)]。所得样品采用红外、质谱、核磁并结合熔点测试进行结构确证。

1.3.2 抗炎镇痛活性研究

(1)细胞培养 将RAW264.7巨噬细胞从液氮中快速取出。复苏后，将细胞加入到含有胎牛血清的DMEM培养基中，置于CO2恒温培养箱中培养。当RAW264.7细胞完全贴壁生长至80%时，用胰蛋白酶消化，按1:3的比例传代，继续培养直至细胞完全贴壁生长至80%时，用于后续的实验。

(2)细胞分组与干预 将RAW264.7细胞分为正常对照组、模型对照组(LPS，1 μg/mL)、CA低、中、高剂量组(4、8、16 μmol/L)。除正常对照组外，各组均给予1 μg/mL的LPS构建炎症模型。

(3)细胞活性测定 采用MTT法检测RAW264.7细胞活力。取RAW264.7细胞接种于96孔板中，每孔的细胞密度为4×104个。置于5% CO2恒温(37℃)培养箱中培养。12 h后，弃去培养液，用不同浓度的CA(1、2、4、8、16、32 μmol/L)处理细胞并在相同的条件下孵育 12 h，加入 10 μL MTT后继续置于培养箱中培养。4 h后，弃去培养基，于每孔中加入100 μL DMSO。使用全自动酶标仪测量每孔在450 nm处吸光度值，计算细胞活力。此外，评价CA对LPS诱导的RAW264.7细胞损伤保护作用时，用不同浓度的松柏醇(4、8和16 μmol/L)处理细胞并在相同的条件下孵育 12 h。4 h后，除正常对照组外，各组均加入1 μg/mL的LPS。然后在相同的条件下继续孵育，24 h后，测定细胞活力。

(4) NO含量和PGE2测定 RAW264.7细胞接种及培养条件同上。用不同浓度的CA(4、8、16 μmol/L)处理细胞并在相同的条件下孵育。4 h后，除正常对照组外，各组均加入1 μg/mL的LPS。然后在相同的条件下继续孵育，24 h后，格里斯试剂法测定NO的产生量。具体方法为：分别吸取50 μL上清液，转移到另一个96孔板中，并加入50 μL格里斯试剂A，充分混匀。在室温下放置5分钟后，加入100 μL 格里斯试剂B，充分混匀。5分钟后，使用酶标仪测量每孔样品在540 nm处的吸光度。采用酶联免疫吸附法测定试剂盒测定细胞液中PGE2的生成水平，酶标仪上的测定波长为405 nm。

(5)TNF-α、IL-6和IL- 1β含量测定 分组及细胞处理同上，取细胞培养液，按照酶联免疫吸附测定试剂盒说明书所列方法测定细胞液中TNF-α、IL-6及IL- 1β的含量。用于测定TNF-α、IL-6、和IL-1β的样品至于酶标仪中，测定450 nm处吸光度，并计算含量。

(6)角叉菜胶诱导小鼠足肿胀实验 本研究采用角叉菜胶致小鼠后足水肿模型评价CA的在体抗炎活性。将小鼠随机分为生理盐水(10 ml/kg，i.p.)、吲哚美辛(INDO，40 mg/kg，i.p.)及松柏醇(20、40和80 mg/kg，i.p.)组。给药前，先用电子数显卡尺测定每只小鼠后脚趾的初始厚度。腹腔给药30 min后，将浓度为2%的角叉菜胶溶液皮下注射到小鼠右后爪。分别于注射角叉菜胶后60、120、180 min用电子数显卡尺测量小鼠右足趾厚度，计算抑制率。

(7) 醋酸致小鼠扭体法 采用0.7 %醋酸致小鼠扭体实验模型评价CA的在体镇痛活性。分组和给药与“1.3.2-(6)”项下类似。给药30 min后，每只小鼠腹腔注射0.7 %醋酸溶液(0.1 mL/10 g)。记录每只小鼠在0～30 min内腹部收缩或拉伸的次数，评价镇痛作用强弱。

1.3.3 统计学处理 抗炎及镇痛活性数据均以“均值±标准差”的形式展示。使用GraphPad Prism 5进行分析并绘制图形。计量资料采用单因素方差(One way ANOVA)分析， Newman-Keuls 法进行多重比较；率的比较采用卡方检验。以P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 松柏醇的结构表征 本研究共合成中间体阿魏酸乙酯(浅黄色固体产物)10.3 g (收率 89.4%)。经核磁确认和已报道的阿魏酸乙酯结构相符合；共合成1.1 g 松柏醇纯品(白色固体产物)，收率为61.1%。经核磁、质谱等确认和已报道的CA的结构相符。阿魏酸乙酯1及CA 2的理化性质和波谱数据如下：

2.2 松柏醇对 RAW264.7 巨噬细胞活力的影响 本实验中，采用MTT考察了不同浓度的CA预处理RAW264.7细胞的生长情况。结果表明，与正常对照组相比，CA在1,2,4,8,16和32 μmol/L剂量下对RAW264.7细胞的生长无显著抑制作用(P=0.8356)，见图2A。其在32 μmol/L也没有明显的细胞毒性(细胞存活率>85%)，表明在该浓度范围内，CA对RAW264.7细胞无细胞毒性。由图2B所示，与正常对照组相比，1 μg/mL LPS可显著抑制RAW264.7细胞生长(P<0.05)。与LPS组相比，CA在4,8 和16 μmol/L浓度下可提高LPS诱导的RAW264.7细胞活力，且呈现明显的剂量依赖性。其中，CA在16 μmol/L时显著提高LPS刺激RAW264.7细胞的存活率(P<0.05)。因此，CA对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞损伤具有较好的保护作用。

#：与正常组相比，P<0.05；*:与模型组相比，P<0.05。图2 不同浓度CA对 RAW264.7 细胞活力的影响

2.3 松柏醇对NO释放和PGE2生成的影响 如图3A所示，CA在浓度为4、8和16 μmol/L时表现出不同程度的NO抑制作用。值得注意的是，CA在8和16 μmol/L时对NO释放的抑制率分别为38.28%和52.56%。如图3B所示，在 LPS 刺激后，PGE2生成量显著增加(P<0.001)。与LPS组相比，CA可剂量依赖性地降低PGE2水平，其在4，8和16 μmol/L时的抑制率分别为17.77%，38.94%和48.54%。

###:与正常组相比，P<0.001；*、**、***:分别与模型组相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001。图3 CA对NO释放和PGE2生成的影响

2.4 松柏醇对TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响 通过ELISA法检测CA对LPS诱导RAW264.7细胞培养液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的变化。结果表明，与正常对照组相比，LPS诱导组细胞培养液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均显著升高(P<0.001)。如图4A所示，CA对TNF-α的含量影响不大，仅在16 μmol/L时降低TNF-α水平(P<0.05)。如图4B所示，CA(4、8 μmol/L)干预后细胞培养液中的IL-1β含量有所降低，但差异不显著(P>0.05)，而CA(16 μmol/L)组IL-1β含量降低具有极显著的统计学意义(P<0.001)。如图4C所示，与模型组相比，CA在8 和16 μmol/L的剂量干预后可明显下调细胞上清液中IL-6的水平。结果表明，松柏醇可抑制炎症细胞因子和介质，如TNF-α,IL-6等。

###：与正常组相比，P<0.001；**、***:分别与模型组相比，P<0.01，P<0.001。图4 CA对TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响

2.5 松柏醇对角叉菜胶诱导小鼠足肿胀程度的影响 在体实验结果显示，与模型组相比，腹腔注射松柏醇(20、40 mg/kg)能显著减少角叉菜胶致小鼠1 h、2 h和3 h时的足肿胀程度，且显示出一定的时间和剂量依赖性(见图5A)。由图5B所示，模型组小鼠注射角叉菜胶后1 h、2 h和3 h的足肿胀率分别为31.21%、45.83%和50.42%。阳性药吲哚美辛(10 mg/kg)小鼠1 h、2 h和3 h足肿胀率分别为18.27%，24.76%和 29.97%。CA与阳性药作用类似，CA(40 mg/kg)给药后小鼠在1 h、2 h和3 h时的足肿胀率分别为10.28%，14.19%和 21.74%，显示出较好的抗炎活性。

*、**、***：分别与模型组相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001。图5 CA对角叉菜胶诱导小鼠足肿胀程度的影响

2.6 松柏醇对醋酸致小鼠扭体反应的影响 在醋酸诱导的小鼠扭体反应实验中，与模型组比较，CA在20和40 mg/kg剂量下显著减少小鼠扭体次数(见表1)，抑制率分别为48.49 %(P<0.01)和61.53%(P<0.01)。阳性药吲哚美辛(20 mg/kg)也显示出类似的抑制作用，抑制率为85.27%(P<0.001)。

表1 CA对醋酸致小鼠扭体反应的影响

3 讨论

本研究首先以阿魏酸为原料，合成了1.1 g松柏醇纯品，并采用RAW264.7细胞和小鼠炎症及疼痛模型评价了松柏醇的抗炎镇痛活性。动物实验结果表明，与非甾体抗炎药吲哚美辛相似，松柏醇具有显著的在体抗炎镇痛活性。体外活性研究揭示，松柏醇能提高LPS刺激RAW264.7细胞存活率，且显著减少炎症因子产生，从而发挥抗炎作用，这为松柏醇在抗炎方面的研究或应用提供实验支持。

炎症在组织的防御反应中起着重要作用，用以应对病原体、外源性物质、辐照甚至应对受损细胞[13]。巨噬细胞活化在多种炎症性疾病的发病机制中发挥作用。LPS是一种激活多种炎症信号的病原体，LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症损伤被广泛用作体外抗炎药物筛选的经典模型。在LPS刺激下，小鼠RAW264.7巨噬细胞可分泌多种炎症介质或促炎因子，如NO、PGE2、TNF-α、IL-6、IL-12、IL-23、IL-1β和COX-2等，这些炎症介质和细胞因子水平的升高与炎症性疾病的发生发展密切相关[14-15]。其中，巨噬细胞中TNF-α和IL-1β分泌的降低有助于体内平衡的恢复，有助于中性粒细胞在受伤部位的积聚，从而吞噬病原体，并释放化学物质，改善损伤。此外，炎症相关介质也是LPS诱导炎症疾病的重要靶点，这些细胞因子水平的变化经常被用作评价抗炎药物活性的重要指标。因此，能够抑制炎症介质和细胞因子产生或释放的化合物具有开发为新型抗炎药物的潜质。研究发现，腹腔注射CA可减少上述炎症介质和促炎因子的释放，表现出较好的抗炎作用。

角叉菜胶诱导的炎症主要症状表现为炎症水肿，痛觉敏化等，其可增强双相炎症级联反应：早期阶段包括组胺、白三烯、激肽和环氧合酶的大量分泌，晚期阶段则伴随着白细胞的聚集和炎症组织中前列腺素和缓激肽的过多生成。通常这些炎症因子可以在受损伤部位自身产生，也可以通过浸润细胞产生。炎症反应强弱通常是通过小鼠足水肿程度来评价的，这一模型在抗炎药物开发中发挥了重要作用。角叉菜胶炎症模型可通过诱导TNF-α、IL-1β及角质形成细胞源性趋化因子等炎症相关的细胞因子的产生和释放引起小鼠痛觉过敏，造成炎性损伤[16-17]。在角叉菜胶诱导的小鼠足肿胀模型中，CA可降低角叉菜胶诱导的小鼠足肿胀程度，表明细胞因子的产生或作用受到干扰可能与松柏醇抗炎机制密切相关。醋酸诱导的小鼠扭体实验模型通常用于评价外周镇痛药，其主要通过增加内源性物质如前列腺素，如PGF2α和PGE2，以及缓激肽、组胺和血清素等[18-19]产生痛觉反应。这些内源性物质的大量释放可造成外周伤害性敏化反应产生腹部扭体反应，引起进一步的伤害性反应。本研究发现CA的镇痛活性与吲哚美辛相似，而吲哚美辛是一种非甾体抗炎药，主要通过减少外周组织中前列腺素的生物合成发挥抗炎镇痛作用。

综上所述，松柏醇体外显著降低NO、TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2的水平，表现出中等程度的在体抗炎镇痛作用，且呈剂量依赖性。这些结果充分表明以松柏醇为母核结构进一步设计或开发新型抗炎剂具有较好研究价值。