长链非编码RNA同源盒基因 A11反义RNA在急性淋巴细胞白血病患儿骨髓中的表达及意义

白东琴，白玉，田富香

延安市人民医院儿内科，陕西 延安 716000

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是血液系统常见的恶性肿瘤之一，起源于造血干细胞和造血祖细胞，其特征为未成熟的白细胞大量聚集在血液、骨髓、淋巴结、脾脏及其他器官。人

ABL

基因位于9号染色体长臂，9号染色体长臂上

C-ABL

原癌基因易位至22号染色体长臂的断裂点集中区（BCR），形成

BCR/ABL

融合基因。儿童ALL约占儿童急性白血病的80%，一般经过规范化治疗，患儿的长期生存率为70%～80%，但ALL的复发率高，且一旦复发疾病进展快，病死率高。目前普遍认为，遗传因素、环境影响、基因改变可能是导致ALL发生的危险因素，但尚不清楚ALL的确切病因及发病机制。因此，寻找潜在的治疗靶点成为当前ALL的研究热点。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类不编码蛋白质RNA，其长度超过200个核苷酸。研究发现，lncRNA的异常表达不仅可导致多种实体瘤，还也与白血病的发生发展密切相关。lncRNA同源盒基因A11反义RNA（lncRNA homeobox A11 antisense RNA，HOXA11-AS）是一种位于染色体7p15.2上的新型lncRNA。研究显示，lncRNA HOXA11-AS与多种恶性肿瘤有关，但尚无与急性淋巴细胞白血病的研究报道。本研究探讨HOXA11-AS在ALL患儿骨髓中的表达及意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年3月至2021年3月延安市人民医院收治的初治ALL患儿。纳入标准：均经骨髓细胞学、免疫分型检查、分子生物学及遗传学检查确诊。排除标准：初诊前接受过化疗或ALL相关治疗。依据纳入和排除标准，本研究共纳入108例初治ALL患儿，其中男66例，女42例；年龄3～12岁，平均（6.27±1.95）岁；病理类型：B淋巴细胞型（BALL）67例，T淋巴细胞型（T-ALL）41例。同期选取本院收治的57例非肿瘤性疾病（血友病、免疫性血小板减少症等）患儿，其中男34例，女23例；年龄4～12岁，平均（7.01±1.62）岁。三组患儿性别、年龄比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）。取108例初治ALL患儿的骨髓标本和57例非肿瘤性疾病患儿的骨髓标本。

1.2 治疗方法

所有初治ALL患儿均依据《儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第四次修订）》中的治疗方案进行治疗（以化疗为主），均接受2个疗程的治疗，治疗结束后评价患儿的治疗效果。

1.3 实验方法

1.3.1 主要试剂和仪器人淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司，Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，HOXA11-AS引物购自上海生工生物工程股份有限公司，Prime Script逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒和SYBR Premix Ex-Taq Ⅱ试剂盒购自日本Takara公司。NanoDrop 2000C超微量分光光度计购自美国Thermo公司，7300型实时聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪购自美国ABI公司。

1.3.2 实时RT-PCR法检测骨髓标本HOXA11-AS的相对表达量 取108例初治ALL和57例非肿瘤性疾病患儿治疗前的骨髓液2 ml，乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝处理，加入等量磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）充分混匀，再加入等量人淋巴细胞分离液，3000 r/min离心10 min，吸取中间层的单个核细胞，转移至新的离心管中，加入PBS洗涤1次后，使用Trizol试剂提取总RNA，应用NanoDrop 2000C超微量分光光度计检测RNA浓度和质量。根据Prime ScriptRT-PCR试剂盒说明书将RNA逆转录成互补DNA（complementary DNA，cDNA），反应过程：42℃15 min，85℃10 s，然后参照SYBR Premix Ex-Taq Ⅱ试剂盒说明书进行RT-PCR反应，反应总体积为20µl，其中包含3µl稀释和预扩增的cDNA、上下游引物各0.25 μl，10 µl SYBR预混料ExTaq和1µl荧光探针、5.5µl无RNA酶水，反应条件：95℃预反应10 min，然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40次循环。所有样本均设3个复孔，并计算每个样本的平均值，以3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，使用生物系统软件RQ Manager v1.2.1处理数据，采用2方法计算HOXA11-AS的相对表达量。HOXA11-AS上游引物：5'-GCCACAUGCACCCGCCUGCUGAA-3'，下游引物 ：5'-CAUCAGACACAGUCCACUAUGCG-3'；

GAPDH

上 游引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'；下游引物：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 HOXA11-AS相对表达量的比较

108例初治ALL患儿骨髓HOXA11-AS的相对表达量为（4.79±1.08），明显高于非肿瘤性疾病患儿的（1.13±0.38），差异有统计学意义（

t

=24.759，

P

=0.000），其中B-ALL型初治ALL患儿骨髓HOXA11-AS的相对表达量为（4.26±0.93），明显低于T-ALL型患儿的（5.66±1.33），差异有统计学意义（

t

=6.429，

P

=0.000）。108例初治ALL患儿经2个周期的化疗后完全缓解46例，未完全缓解62例，完全缓解患儿HOXA11-AS的相对表达量为（1.46±0.35），明显低于未完全缓解患儿的（3.28±0.94），差异有统计学意义（

t

=3.262，

P

=0.000），且完全缓解和未完全缓解患儿骨髓HOXA11-AS的相对表达量均明显低于初治ALL患儿的（4.79±1.08），差异有统计学意义（

F

=7.203，

P

=0.000）。

2.2 不同临床特征初治ALL患儿骨髓HOXA11-AS相对表达量的比较

不同性别、年龄、染色体核型、原始细胞比例、白细胞计数、血红蛋白水平、血小板计数、

WT1

基因表达情况初治ALL患儿骨髓HOXA11-AS相对表达量的比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）；

BCR/ABL

融合基因阳性表达初治ALL患儿骨髓HOXA11-AS的相对表达量，明显高于

BCR/ABL

融合基因阴性表达患儿，差异有统计学意义（

P

＜0.01）。（表1）

表1 不同临床特征初治ALL患儿骨髓HOXA11-AS相对表达量的比较（ n=108）

3 讨论

ALL是由于造血干细胞恶性增殖、凋亡受阻导致的原始与幼稚淋巴细胞分化受阻，抑制正常的造血功能，侵犯髓外器官的血液系统常见恶性疾病之一。虽然经过规范化治疗，ALL的缓解率较高，但复发率也较高，且疾病一旦复发，进展快、病死率极高。因此，探讨ALL的发病机制和耐药机制对改善ALL的治疗效果具有重要意义。

lncRNA曾被认为是“暗物质”，但随着研究的不断深入，越来越多的证据表明这些“暗物质”具有极为重要的生物学功能。研究显示，lncRNA的异常表达可导致多种实体瘤，如肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等，且lncRNA的异常表达也与白血病的发生发展密切相关。有研究报道，ALL患者骨髓细胞中存在lncRNA的异常表达，甚至可能导致肿瘤细胞耐药。有研究发现，lncRNA锌指E-盒结合同源异形盒1-反义链1（zinc finger E-box binding homeobox 1 antisense 1，ZEB1-AS1）在B-ALL型患者骨髓中的表达明显高于对照组，可与白细胞介素-11结合，并促进其表达，且高表达ZEB1-AS1的B-ALL型患者的预后更差。另有研究发现，lncRNA RP11-137H2.4在ALL患儿中明显高表达，主要通过促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）级联与细胞周期通路导致糖皮质激素耐药的发生。

HOXA11-AS是一种位于染色体7p15.2上的新型lncRNA。研究显示，HOXA11-AS与多种恶性肿瘤有关，但目前与ALL相关的研究报道较少。本研究结果显示，初治ALL患儿骨髓HOXA11-AS的相对表达量明显高于非肿瘤性疾病患儿，提示HOXA11-AS过表达可能与ALL的发生有关。本研究结果还显示，B-ALL型初治ALL患儿骨髓HOXA11-AS的相对表达量明显低于T-ALL型患儿，提示HOXA11-AS在不同类型的ALL中的表达存在差异。进一步结合初治ALL患儿的临床资料分析发现，不同性别、年龄、染色体核型、原始细胞比例、白细胞计数、血红蛋白水平、血小板计数、

WT1

基因表达情况的初治ALL患儿骨髓HOXA11-AS的相对表达量均无明显差异（

P

＞0.05），但

BCR/ABL

融合基因阳性表达初治ALL患儿骨髓HOXA11-AS的相对表达量，明显高于

BCR/ABL

融合基因阴性表达患儿（

P

＜0.01）。本研究结果还显示，完全缓解患儿HOXA11-AS的相对表达量，明显低于未完全缓解组和初治ALL患儿，提示HOXA11-AS的高表达可能与ALL患儿的不良预后有关，但仍有待进一步扩大样本量再次证实。综上所述，HOXA11-AS在初治ALL患儿骨髓中高表达，且在T-ALL型患儿中高表达，化疗后完全缓解和

BCR/ABL

融合基因阴性表达的ALL患儿骨髓中HOXA11-AS的相对表达量更低，提示HOXA11-AS可能参与ALL的发生发展过程，并与ALL患儿的预后有一定关系。