双室微生物燃料电池对土壤中铅的去除研究

陆洪省，吴玉斌，张 瑶

(山东科技大学安全与环境工程学院，山东 青岛 266590)

传统的双室微生物燃料电池（Microbial fuel cell，即MFC）是由阳极室与阴极室组成，中间由质子交换膜隔开[1]，由于使用质子交换膜导致成本昂贵，通常膜（如使用Nafion117膜）的成本占全部费用的50%[2]以上，所以，本研究是以盐桥为质子交换通道，节省了大量成本。

产电细菌的种类很多，包括变形杆菌Proteobacteria、厚壁菌Firmicutes、土杆菌Geobacteraceae、拟杆菌Bacteriodetes及放线菌Actinobacteria[3]等。在多种细菌存在的条件下，研究MFC电子传递非常复杂，因此，考察单一产电细菌的电子传递机理，就成为提高MFC产电性能的重要途径之一。

目前，全世界平均每年排放约500万t铅，其中大部分会进入土壤[4]。在我国320个重金属重点污染区中，铅是最严重的污染元素之一[5]。现阶段，对于重金属铅污染的土壤进行治理的方法有物理化学法和生物修复法，其中，物理化学法对土壤搅动大，费用高，而生物修复法见效慢，且极易受土壤理化性质以及气候环境条件的影响，所以，利用微生物燃料电池（MFC）方法富集或去除土壤中重金属铅的报道非常少！

本研究首先从活性污泥中分离产电细菌，将此单一产电细菌在阳极室中培养，而阴极室中填充土壤，利用土壤双室MFCs装置进行研究以下研究：在土壤中添加葡萄糖对MFC产电性能的影响；阴极室土壤中Pb2+在MFC条件下的迁移规律；产电细菌的生理生化性质以及分类学位置，以此为利用土壤MFCs富集土壤中的重金属同时产生电能提供理论依据。

1 实验

1.1 MFC实验装置

采用双室MFC，实验装置如（图1）所示。中间为阳极室，两边为两个阴极室，阴极室暂命名为1号和2号阴极室。阳极室尺寸30 cm×30 cm×20 cm（长×宽×高），两个阴极室尺寸相同，均为20×20×15 cm（长×宽×高）。阳极石墨板尺寸为10 cm×10 cm×0.5 cm（长×宽×厚），面积为100 cm2；阴极石墨板的尺寸均为5.0 cm×4.5 cm×0.4 cm（长×宽×厚），板面面积为22.5 cm2，阳极室与阴极室（1号和2号）分别用盐桥连接。分别在1号和2号阴极室中填充土壤，土壤取自山东科技大学校园内，土壤取来后应先进行风干、研碎和过筛（目）。

图1 微生物燃料电池装置示意图

盐桥制作过程：准确称取4 g琼脂加入到盛有200 ml蒸馏水的烧杯中，加热使琼脂完全溶解。再称量60 g KCl加入到烧杯中，继续加热，使KCl完全溶解，趁热将混合液注入到U型塑料管中，塑料管两口朝上，直至溶液溢出管口[6]。

1.2 产电细菌的分离与纯化

在阳极室中添加乙酸钠液体培养基，用于培养产电细菌。培养基组成（g·L-1）为：乙酸钠为0.8，NH4Cl为0.31，KCl为0.13，Na2HPO4·12H2O为3.75，NaH2PO4·H2O为4.9，1 000 mL去离子水，用盐酸或氢氧化钠调节pH值至7.2，其中，在配制固体培养基时加入20 g琼脂，配制半固体培养基时加入4 g琼脂，液体和固体培养基均在121 ℃灭菌20 min后使用。

产电细菌分离于活性污泥的方法：将10 mL活性污泥加入到盛有190 mL的乙酸钠液体培养基的三角瓶中，恒温振荡（130 r/min，30 ℃）培养4 d，取15 μL培养液划线培养到乙酸钠固体培养基上，30 ℃静置培养，待长出菌落后，挑选单菌落，并多次重复划线，直至菌落形态等一致，将分离纯化的菌株保存在半固体培养基中，待用。

1.3 MFC的运行及产电性能的计算

将分离纯化到的菌株接种到阳极室中的乙酸钠液体培养基中（培养基的组成同1.2），在30 ℃条件下培养8 d，细菌挂膜完成。然后利用盐桥将阳极室分别与两阴极室相连，最后连接数据采集系统，此时，MFCs开始运行。在阳极室中利用厌氧袋创造厌氧环境，阴极室中土壤定期进行补湿，将MFCs置于30 ℃恒温培养箱中；电池性能数据用RDAM-4017模块进行采集，电压电流分析软件用数控6.1，其中输出电压（U）每10 S采集一次数据；外接5位可变直流电阻箱（型号：TAS986）。其中，电流通过公式I=U/R计算得出，式中I 为电流，U为输出电压，R 为外回路电阻，内阻、电压-电流密度（V-J）以及功率-电流密度（P-J）测定均参照文献[7]中进行，阴极石墨板面积用来计算电流密度。

1.4 阴极室土壤中Pb2+浓度测定

在MFCs运行结束后，分别取距离阴极石墨板等距离处的土壤，如（图2）所示，即1号阴极室1和4（0cm处），2和5（5 cm处），3和6（10 cm处）位置的土壤，2号阴极室7和10（0cm处），8和11（5 cm处），9和12（10 cm处）的土壤各50 g，分别溶入200 mL去离子水中，充分搅拌、静置，测定上清液中Pb2+的浓度，以平均值作为最终土壤中Pb2+浓度。Pb2+浓度测定采用原子吸收分光光度计（型号：TAS986）法，具体测定方法应按照原子吸收分光光度计测定步骤进行。

图2 阴极室土壤的采集（导线处即为阴极电极板所在处）

1.5 产电细菌生理生化性质的分析及DNA的提取、测序、系统分类学位置的确定

产电细菌生理生化性质测定按照《常见细菌系统鉴定手册》方法进行。该方法是利用柱式细菌基因组抽提试剂盒（UNIQ-10）对产电细菌DNA进行提取，提取方法按试剂盒说明书进行。PCR扩增用引物为细菌16S rDNA通用引物，由上海生物工程公司对菌株16S rDNA进行测序，测得的16S rDNA序列通过DDBJ（DNA Data Bank of Japan）数据库中的Blast进行相似性比对，再利用CustalX2.0和Mega5（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）软件创建系统树，创建方法为邻接法（Neighbor-Joining）。

2 结果

2.1 MFC输出电流密度和电压的分布

当MFC运行0～10 d，在土壤中添加葡萄糖跟未添加葡糖糖的两种条件下，电压升高幅度很慢，且两种处理条件下电压值均低于10 mV，但运行10 d后，土壤在两种处理条件下MFC产生的电压均在迅速增大，且土壤中添加葡萄糖的MFC产生的电压明显要高于未添加葡萄糖土壤的MFC产生的电压，在MFCs运行15 d之后，两种处理条件下的电压值变化幅度变小，此时土壤中添加葡萄糖的MFC产生的电压远远高于土壤中未添加葡萄糖的MFC产生的电压，如图3所示。

图3 土壤在两种处理条件下MFCs的输出电压曲线

为了表征土壤在两种处理条件下MFC的电化学性能，本研究采用电流密度（Current density）-电压（Voltage）进行说明，如（图4）所示。外加电阻变化范围为200～900 000 Ω，从（图4）中可以看出，当外电阻在5 000～900 000 Ω变化时，土壤中添加葡萄糖电池的电压（1号阴极室）远远高于土壤中未添加葡萄糖电池的电压（2号阴极室），且1号阴极室最大电压是65.5 mV，2号阴极室最大电压是24.8 mV；而当外电阻在200～5 000 Ω之间变化时，两者（1号阴极室和2号阴极室）所产生的电压非常接近。

图4 电流密度和电压关系

从电流密度-功率密度曲线（图5）中可以看出，外电阻在200～900 000 Ω之间变化时，土壤中添加葡萄糖（1号阴极室）以及未添加葡萄糖（2号阴极室）的两组MFC，其产生的功率密度非常接近，当外电阻为1 300 Ω时，土壤中添加葡萄糖的MFC产生的最大功率密度为91.95 W·m-2，当外电阻为1 400 Ω时，土壤中未添加葡萄糖的MFC产生的最大功率密度为87.5 W·m-2。

图5 阴极室中土壤的不同处理对MFCs功率密度的影响

2.2 不同取样点土壤中Pb2+的浓度测定结果

向阴极室土壤中分别喷洒浓度为16.74 g/L的硝酸铅溶液900 mL，搅拌均匀后，测得Pb2+初始浓度为3.125 g/kg。当MFCs运行结束后，分别取距离石墨板0 cm、5 cm和10 cm处的土壤50 g，用200 ml去离子水浸泡12 h，在浸泡过程中不断搅拌，使土壤中Pb2+溶出到去离子水中，静置5 h，取上清液，利用原子吸收分光光度计测定浸出液中Pb2+的浓度，其测定过程按照原子吸收分光光度计说明书操作，在得到Pb2+测定标准曲线后，根据标准曲线计算出不同位置土壤中Pb2+浓度，其结果如（表1）所示。从（表1）中可以看出，在土壤中添加葡萄糖（1号阴极室）和未添加葡萄糖（2号阴极室）的MFCs中，距离电极板越近，土壤中Pb2+浓度越大。通过比较1号和2号阴极室土壤中Pb2+浓度发现，在距离电极板0 cm处，1号阴极室土壤中的Pb2+浓度（5.347 g/kg）远高于2号阴极室土壤中Pb2+浓度（4.725 g/ kg），相反，在距离阴极石墨板5 cm和10 cm处土壤中，1号阴极室土壤中Pb2+浓度明显低于2号阴极室土壤中的Pb2+浓度。

表1 距离阴极板不同距离土壤中Pb2+的浓度

2.3 产电细菌CD-3生理生化性质及分类学位置的分析

2.3.1 菌株CD-3的生理生化性质

按照《常见细菌系统鉴定手册》中操作步骤，对菌株CD-3的生理生化性质进行测定。菌株CD-3为革兰氏阴性细菌，短杆状，氧化酶、过氧化氢酶反应为阳性，其能利用葡萄糖为碳源，但不能利用阿拉伯糖为碳源。

2.3.2 菌株CD-3的系统分类学位置

对菌株CD-3的16S rDNA序列进行PCR扩增，将扩增序列提交到DDBJ获得收录号LC012001。用CustalX2.1和Mega5软件对菌株CD-3的16S rDNA序列以及同源性较高菌株的16S rDNA序列创建系统发育树创建，如图6所示。从图6可以看出，菌株CD-3的16S rDNA序列与菌株Ochrobactrum ciceri（DQ647056）的同源性最高，达98%。因此，菌株CD-3应属于苍白杆菌属，并命名为Ochrobactrum sp.CD-3（LC012001）。

图6 紧邻法构建的基于Ochrobactrum sp.CD-3及相关菌株16S rDNA序列的系统发育树

3 讨论

在土壤中添加葡萄糖跟未添加葡萄糖的两种处理条件下，最大功率密度分别为91.95 mW·m-2和87.5 mW·m-2，对Pb2+迁移的影响前者明显优于后者，且在靠近电极板的位置，添加葡萄糖土壤中的Pb2+浓度远高于未添加葡萄糖土壤中的Pb2+浓度，在远离电极板土壤中Pb2+浓度正好相反，添加葡萄糖土壤中Pb2+浓度远低于未添加葡萄糖土壤中Pb2+浓度。利用最大功率密度求出的MFCs内阻来看，土壤中添加葡萄糖的MFC的内阻为1 300 Ω，未添加葡萄糖MFC的内阻为1 400 Ω。此根据来源于Quan et al.（2013）[8]，An et al.（2013）[9]和Ball（2007）[10]。

本研究中分离到的产电细菌Ochrobactrum sp.CD-3为革兰氏阴性，能够利用乙酸钠、葡萄糖等为碳源，这与产电细菌Ochrobactrum anthropi相似。