绿茶香气及茶叶中香气物质提取与检测方法研究进展

黄东竹，李梦茹，陈 琪，宛晓春

安徽农业大学 茶树生物学与资源利用国家重点实验室/安徽农业大学 茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036

茶叶香气是影响茶叶品质和消费者选择的重要因素，其实质是不同种类的挥发性芳香物质以不同浓度组合并综合作用于嗅觉神经。迄今为止，已从茶叶中分离、鉴定出700多种挥发性物质，其中绿茶中有近200种[1]。由于一些香气活性物质的嗅觉阈值低，使得其对茶叶特征香气的形成具有显著贡献作用，从而成为茶叶等级和产地区分度的特征成分。随着气相色谱质谱联用（GC-MS）、气相色谱嗅觉（GC-O/MS）和二维气相色谱-飞行时间质谱联用技术（GC×GC-TOFMS）的出现与广泛运用，人们陆续发现许多新的化合物，这些化合物即使在浓度很低的情况下也能对茶叶的香气起到重要作用，通过成分鉴定和分析方法的进一步改进，阐明了不同类型茶叶香气差异及其在加工过程中的变化。气相色谱嗅闻技术（GC-O）、气味活度值（OAV）、香气重组和缺失/添加实验是目前鉴定食品中香气活性物质的常用方法[2-4]，这些香气分析技术已帮助学者鉴定出多种决定绿茶香型并区别于其他香气类型的关键香气物质。

绿茶因其具有多种健康功效和独特的香气深受消费者喜爱。根据感官品质，绿茶的香气类型可分为栗香型、清香型与花香型等典型香气类型，这是不同种类挥发性物质以不同浓度组合形成。本文综述了香气化合物与绿茶各种香气类型之间的关系以及茶叶挥发物质的提取与检测方法研究进展，旨在为今后茶叶特别是绿茶香气品质的鉴别与控制等提供参考。

1 不同香气类型绿茶及其关键挥发性化合物

1.1 清香型绿茶（Fresh-scented green tea）及其关键挥发性化合物

作为绿茶香气中典型的香型之一，“清香”是绿茶香气品质优异的重要感官评价特征，包括清香、清高、清纯、清正与清鲜等。该香型茶叶中香气物质主要是C6化合物等脂质降解产物，所含高沸点香气组分含量低，顺-3-己稀醇、二甲硫、反-2-六碳酸与酯类及其他六碳醇、酸与酯类是其中鲜爽型清香的主要组成成分。

径山茶产于浙江省余杭区，其鲜叶采摘嫩度标准为一芽一叶（特级）、一芽二叶初展（一级）和一芽二叶（二级），香气清高、滋味清鲜是其基本的风味特征，特级径山茶香气清鲜、常具花香[5]。Peter课题组通过感官嗅闻结合稳定同位素稀释法（SIDA）确证了高品质径山茶中二甲基硫醚、（E,E）-2,4-庚二烯醛、1-己烯-3-酮、香叶醇与甲硫醇是其最为关键的5个香气活性物质[6]。

王梦琪等[7]通过GC-O-MS法确定二甲基硫醚、松油烯、芳樟醇、萘、(Z)-己酸-3-己烯酯、(E)-β-紫罗兰酮、2-正戊基呋喃、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮和(Z)-2-甲基丁酸-顺-3-己烯酯等化合物的香气特征普遍为草本清香或花香，香气强度较高，且这些化合物也在清香型绿茶中大量检出，表明它们对绿茶“清香”品质形成具有重要贡献。

在日本的多种绿茶产品中，煎茶（Sen-cha）以其典型的清香在市场上占据主导地位。有研究发现，反-2-顺-6-壬二烯醛、3-甲基-2,4-壬烷二酮和Z,Z-3-己烯酸-3-己烯酯等物质带有典型的清香[8-9]，3-甲基-2,4-壬烷二酮同样被鉴定为龙井和毛峰茶汤清香的强效气味化合物[10]。香叶醇是花香属性的代表性化合物，但是随着稀释倍数的增加，其清香气味得以增强；同时一些具有清香气味的醇类和酮类物质也对绿茶“清香”特征具有一定贡献，如反式-2-己烯醇、顺式-3-己烯醇、2-乙基-1-己醇和反式-3,5-辛二烯-2-酮、2-戊基呋喃、己醇等气味活性化合物。

1.2 栗香型绿茶（Chestnut-flavored green tea）及其关键挥发性化合物

“栗香”是我国六大茶类中绿茶所特有的嗅觉感受，具有很高的消费者接受度，同时也是绿茶等级评价的重要指标，常出现在炒青绿茶中。在感官品质方面，栗香型绿茶表现出类似嫩板栗香气，由于其栗香强度与持久度等的差异，感官评审中又可细分为板栗香、嫩栗香与熟栗香[11]。3类栗香型绿茶香气组分的种类基本一致但含量差异较大，其中萜烯类种类最多，醛类物质相对含量最高，占香气化合物总量的29.98% ～ 34.48%。Zhang基于OAV>1准则从3类栗香型绿茶中筛选出12种关键性香气组分，包括6种醛类物质（异丁醛、己醛、庚醛、壬醛、癸醛和苯乙醛）、2种萜烯醇类物质（芳樟醇和1-辛烯-3-醇）、2种酮类物质（1-辛烯-3-酮和β-紫罗兰酮）以及烯烃类的对伞花烃和酯类中的己酸乙酯。萜烯类物质是由β-葡萄糖苷酶参与产生的香气物质，是绿茶中花果香的重要物质基础。醛类物质通常给人以愉悦的感官体验，参与形成特殊的香气风格。此外，在香气重组实验中，3类典型栗香重组样与对照样的相似度值均在0.97以上，较好地验证了这12种关键香气组分对栗香风味的影响[12]。

朱荫等采用GC×GC-TOFMS结合气味活度值（OAVs）与GC-O分析比较了典型栗香型绿茶以及不同加工工艺条件下所制板栗（生板栗、煮板栗、烤板栗）的挥发性香气成分。研究结果表明，绿茶的栗香与煮板栗的香气更为接近，且乙苯、庚醛、苯甲醛、2-戊基呋喃、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、芳樟醇、顺-己酸-3-己烯酯和反式-β-紫罗酮等8种化合物被认为是促进绿茶“栗香”形成的最有效香气物质。比较鲜叶及其成品茶中这些关键气味化合物的OAVs发现，顺-己酸-3-己烯酯和反式-β-紫罗酮呈现显著增加的趋势，而庚醛、2-戊基呋喃和(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮的表现趋势则相反[13]。

在对具有栗香香型的峨眉毛峰进行不同的温度、时间处理后发现，栗香香气强度可发生变化，香型亦可转化为尚高、较高、纯正及足火等香型。因此，在加工栗香型茶叶时应注意温度和时间的控制，以获得愉悦、持久及强度适宜的香型[14]。

1.3 花香型绿茶（floral green tea）及其关键挥发性化合物

“兰花香”是高档名茶品质优异的独特标志之一，带有兰花香的绿茶更被认为是不可多得的好茶。通过审评兰花和带有兰花香的太平猴魁和舒城小兰花发现，兰科植物中蕙兰（Cymbidium faberi）的花香与茶叶兰花香最为相似，并将这种香气描述为具有茉莉花和玉兰花般的头香和体香，并带有类似猕猴桃果香的底韵。FENG等运用GC-O和芳香提取物稀释分析（AEDA）方法进一步明确了顺式表茉莉酸甲酯（epi-MeJA）不仅对蕙兰香气起主要贡献作用，同样也是太平猴魁等兰花香型茶叶香气的主要贡献化合物，从分子水平上揭示了高品质茶叶具有“兰花香”的奥秘[15]。顺式表茉莉酸甲酯（epi-MeJA）和顺式茉莉酸甲酯（MeJA）为茉莉酸甲酯的两个表型异构体，二者均具有十分类似兰花的香气，其中顺式表茉莉酸甲酯的气味阈值（3 μg/L）仅为非表型结构的1/400，是茶叶兰花香的主要香气活性物质。当按照1∶50的茶水比冲泡时，茶叶中顺式表茉莉酸甲酯的浓度须大于0.15 μg/g才能达到它在茶汤中的气味阈值[15-16]，在多数乌龙茶中顺式表茉莉酸甲酯通常处于气味活性浓度，而在其他茶类中往往因其含量太低而对茶汤香气难以起到显著贡献作用。

异丁香酚可为茶叶提供一种花香与香辛料的味道，被认为是对我国绿茶包括龙井、毛峰及碧螺春等茶的花香起重要贡献作用的物质。研究表明，松柏醇是生成异丁香酚的重要中间体，在萎凋和杀青过程中前体物松柏苷经酶促反应生成松柏醇，而后在杀青和干燥过程中松柏醇受热发生还原脱水反应（the reducing dehydration reaction）形成异丁香酚[10]。

萜烯类物质如芳樟醇（linalool）与香叶醇（geraniol）等广泛存在于各类茶叶中，是茶叶中花香气味属性的典型代表物质，春茶中芳樟醇的FD值明显高于夏茶，表明春茶中芳樟醇的含量高于夏茶，而茶叶香叶醇的合成受季节因素影响较小。芳樟醇的对映体选择性分析结果显示，高品质带有花香的径山茶中(S)-芳樟醇虽然含量高（92%），但(R)-芳樟醇由于气味阈值较低而具有较高的OAV值[6]。

此外，吲哚也是一种重要的香气物质，一方面给茶叶花香起重要贡献作用，另一方面可强化绿茶的整体香气特征。

3种香型绿茶特征挥发性化合物及其描述见表1。

表1 3种香型绿茶特征挥发性化合物及其描述与提取方法Table 1 Characteristic volatile compounds of three aroma types of green tea and their description and extraction methods

续表

2 茶叶中香气物质的提取与检测

2.1 茶叶中香气物质的提取方法

由于茶叶香气物质组成复杂、含量低微、易挥发、不稳定，因此最大程度地将其从样品中提取分离并浓缩至可检测水平是研究茶叶香气品质必不可少的技术手段。研究表明，茶叶的整体香气轮廓与采用的样品前处理技术密切相关，不同提取方法使得茶叶香气物质在定性和定量上存在差异。从复杂基质中富集挥发性芳香化合物的技术应满足：（1）不应区分对某种风味贡献很大的化合物；（2）所应用的条件不应改变关键芳香化合物的结构；（3）应彻底清除可能干扰气相色谱分离的非挥发性化合物。

2.1.1 溶剂辅助风味蒸发法

溶剂辅助风味蒸发法（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）是一种新的多功能技术，用于直接、仔细地分离复杂食品基质中的挥发物。SAFE系统为蒸馏单元与高真空泵的紧凑结合，有利于提取高分子量低挥发性化合物，其优点包括：对极性高的风味物质有较高的回收率；能直接蒸馏含水样品；能得到真正、可靠的风味物质，即用这种新的方法得到的风味提取物在感官上与原被提取物几乎一样[17]。近年来，SAFE技术作为色谱分析前的样品预处理方法被广泛用于研究茶叶中复杂的香气组分，该前处理方法在不过度加热的情况下得到的挥发性浓缩物充分再现了茶汤的特征香气，因此被认为是通过GC-O法筛选强效气味的最佳样品前处理方法。Mario Flaig等利用溶剂辅助风味蒸发法对径山茶的香气成分进行提取分析，结合GC-O与GC-MS和香气提取物稀释分析后发现58种气味活性化合物[6]。Mario还使用溶剂辅助风味蒸发法对龙井茶的香气物质进行提取，结合香气提取物稀释分析进行处理并通过稳定同位素稀释分析对筛选出的目标化合物进行定量，然后在水溶液中对龙井香气进行模拟重组，成功还原了龙井茶的香气[18]。

2.1.2 固相萃取法

固相萃取法（solid phase extraction，SPE）是利用选择性吸附与选择性洗脱的分离原理对液体样品进行选择性吸附，保留待测物质，然后用洗脱液进行选择性洗脱，达到收集目标化合物的目的。Feng采用包括固相萃取法在内的三种香气前处理方法对相同品种、相同区域以六大茶类加工方法处理的新鲜茶叶的香气成分进行提取，结合GC-MS进行分析，共鉴定出了168种挥发性化合物，其中红茶的挥发性物质浓度最高，绿茶最低[19]。Chen等人以固相萃取法作为样品前处理手段，以气相色谱为分离技术，使用质谱等检测系统结合感官分析对汉中红茶的香气成分进行表征，共鉴定和定量出茶叶浸出物中73种香气组分，确定了花香、蘑菇味和焦糖味在汉中红茶的香气属性中占主导地位[20]。西南大学崔继来在探究糖苷类香气前体对乌龙茶和红茶香气形成的贡献时建立了SPE与GC-MS联用的提取检测方法，以苯甲醇、(顺)-3-己烯醇的葡萄糖苷和樱草糖苷等作为标准物对茶叶中的糖苷类物质进行分析[21]。

迄今为止，固相萃取法的发展已经相当成熟，根据目标化合物或杂质的不同已开发出多种不同填料的吸附小柱。SPE具有可同时完成目标化合物的富集与净化、灵敏度高及结果重现性好的优点，但同时进口小柱成本高昂，实验所需的有机试剂量也较大，造成的环境污染与潜在的安全风险是该方法的弊端。

2.1.3 固相微萃取法

固相微萃取技术（solid phase microextraction extraction，SPME）基于分析物在样品基质、气相以及高分子聚合物纤维涂层间的分布系数对待测组分进行萃取，可用于收集干茶和茶汤中的挥发性化合物，具有简单、快速、无溶剂和低成本的特点。受分布系数及纤维涂层选择性吸附的影响，要达到最佳萃取效果，除对萃取纤维的型号进行筛选外还需对茶水比、萃取时间及萃取温度进行优化[22]。顶空固相微萃取（HS-SPME）是一种适用于高挥发性低分子量化合物的顶空提取方法，在该方法下可检测到的硫代乙醇和二甲基硫醚等低分子量含硫化合物在SAFE浓缩液中未发现。甲硫基丙醛和4,5-二氢- 3(2H)-噻吩酮这些弱挥发性化合物可经SAFE方法成功萃取，而HS-SPME的萃取纤维却不能有效捕捉到[23]。王道平等人采用固相微萃取法与同时蒸馏萃取法提取黔玉兰百花湖白茶香气成分，通过GC-MS进行分析鉴定，共鉴别出74个化合物，较完整地得到了黔玉兰百花湖白茶挥发性物质的综合评价[24]。陈娇娇和鲁成银等人结合GC-MS分析，使用包括HSSPME在内的三种香气提取方法对绿茶、白茶和黄茶的香气组分进行比较分析，结果显示HSSPME对茶叶香气成分中的烯类物质和低水溶性物质有良好的富集能力[25]。

2.1.4 同时蒸馏萃取法

同时蒸馏萃取（simultaneous distillation and solvent extraction，SDE）是一种集液液萃取和蒸汽蒸馏萃取优点于一体的技术，具有重现性好及效率高等优点，广泛应用于从多种基质中提取香精油和挥发性化合物[27]，适合于挥发性化合物的定性和定量分析。朱晓凤等人采用同时蒸馏萃取法和顶空固相微萃取法对霍山黄大茶的香气成分进行提取分离，并通过气相色谱-质谱联用对其进行分析鉴定。结果表明，SDE法检测出的挥发性成分有74种，HS-SPME法检测到的挥发性成分有76种，两种方法共同检出的挥发性成分有44种，将两种不同提取手段鉴定出的挥发性物质进行组合，可获得较完整的霍山黄大茶的香气组分[26]。尽管通过该方法可以快速且简单地获得芳香提取物，但在蒸馏过程中升高的温度可能人为导致新的化合物的生成。特别是当样品中存在糖和游离氨基酸时，美拉德反应或Strecker反应可能形成额外的、非真正的芳香化合物，或者可能增加真正的芳香化合物的数量。

2.2 茶叶香气物质检测与分析方法

2.2.1 气相色谱-质谱联用（GC-MS）

气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）是检测食品和植物香气成分最常用的方法，通过GC-MS对挥发性成分进行分离、检测和鉴定。GC-MS灵敏度低、峰容量不足、分辨率低，导致分析效率不高。对食品和植物挥发物的精确定性和定量分析受到明显的重叠峰的限制，从而掩盖了含量低但气味阈值低的关键化合物。二维气相色谱-飞行时间质谱联用技术（GC×GC-TOFMS）是一种较先进的技术，具有峰容量大、信号增强与色谱结构清晰等优点，在食品化学领域引起广泛关注。近年来，GC×GCTOFMS技术也逐渐被应用于茶叶香气成分分析及香气品质鉴别。Yang和Yuan等人采用电子鼻和GC×GC-TOFMS技术对工夫红茶最终干燥过程中香气动态特征进行研究，结果表明不同的干燥温度和干燥时间可赋予红茶不同类型如清香型、花香型和甜香型的香气属性，而研究人员通过GC×GC-TOFMS共鉴定出243种香气物质，通过后续数据处理验证了三种因不同干燥条件加工的工夫红茶呈现不同香型的关键挥发性化合物[28]。Shi采用同时蒸馏萃取法结合二维气相色谱-飞行时间质谱对茯砖茶和普洱茶的挥发性物质进行提取和分析，结合多元分析表明这两种黑茶的芳香化合物存在明显差异[29]。

气相色谱质谱联用仪已被广泛应用于挥发性物质等代谢产物地定性和定量分析。气相色谱嗅闻结合香气萃取稀释分析（AEDA）是识别复杂基质中香气活性物质的有力手段，重构实验则能进一步揭示某一种或几种香气活性物质对整体香气品质的影响。

2.2.2 气相色谱-嗅觉测定（GC-O）

在鉴定出的众多茶叶挥发物中，并不是所有挥发物都具有气味活性并对茶叶的香气特征有贡献。气相色谱-嗅觉测定（Gas Chromatography-Olfactometry，GC-O）通常基于芳香提取液稀释分析（AEDA），将仪器分析与人类感官嗅觉相结合用以筛选食品提取物中有效气味活性物质[30]。AEDA是一种稀释技术，有助于评估复杂的挥发性组分对茶叶整体风味的贡献度，训练有素的评审员在GC-O嗅闻口记录下来自不同稀释倍数芳香提取液中的香气组分的气味属性及强度，从而根据香气稀释因子（Flavour Dilution，FD，能闻到该化合物气味的提取液的最大稀释倍数）来评估单一化合物对样品整体风味的贡献度，FD值越大表示该化合物的贡献越大[31]。由于芳香提取物中的气味物质在GC-O仪器中可完全挥发，然而食品上方顶部空间中气味物质的量取决于其在该食品基质中的挥发性，因此，基于AEDA进行的香气组分评价反应了它们在芳香提取物中的相对重要度。此外，AEDA分析中气味物质的贡献度取决于它们在空气中的气味阈值，而事实上饮茶者感受到的是来自于茶汤的愉悦香气。因此，在食品提取物中测定的FD因子并不表示单一气味对样品整体风味贡献度的精确度量[27]。为了突破这些限制，基于精确定量数据计算化合物的OAV值被认为是进一步解释单一化合物对食品整体风味贡献度大小的必要步骤，通常将OAV≥1的化合物归为关键的芳香化合物，且OAV值越大的化合物对样品整体香气轮廓的贡献越大。

2.2.3 电子鼻技术

电子鼻（E-nose）是一种可以模仿人的气味以评估食品质量的系统，为基于传感器阵列和适当的模式识别方法。与传统的化学分析方法相比，电子鼻技术提供了一种简便快捷的香气质量评估方法，可以检测样品成分的微小变化，用于分类或预测样品之间的差异程度，提供了挥发物的整个场景而不是挥发物的定量分析。王宝怡等人利用电子鼻对山东茶区春、夏、秋茶进行分析，主成分分析和线性判别分析均可将不同季节的绿茶区分开来，同时利用传感器区分贡献度分析还可以鉴定出对香气贡献度较大化合物种类[32]。

近年来，已开发出一种新的使用MS的分支E型鼻（MS-E-nose），由于MS提供了更丰富的样品信息，因此受到研究人员的青睐。在MS-E电子鼻系统中，无需事先进行分离步骤，即将挥发性混合物直接注入电离室，具有出色的灵敏度、选择性和通量。除了电化学传感器和质谱传感器外，比色传感器阵列也是近年来发展起来的。基于比色传感器阵列的新型电子鼻系统由一个化学反应染料制成的比色传感器阵列组成，模仿了哺乳动物的嗅觉，也被称为气味可视化。与近红外方法相似，电子鼻的精度在很大程度上取决于所建立的数据处理和预测模型。开发合适的数据处理方法和构建新的预测模型应该是电子鼻发展的重点。此外，所有通过E-nose获得的数据都是作为一个整体进行分析，不需要详细的挥发性信息，其在定量鉴别、分级和鉴定掺假方面具有优势，但在定量分析方面存在局限性。

2.2.4 分子感官科学

分子感官科学这一概念由德国慕尼黑工业大学的风味化学家Peter Schieberle于2007年提出，是一个在分子水平上对食品感官质量进行多学科交叉分析评价的新技术。分子感官组学主要依赖于GC-MS、GC-O、香气提取物稀释分析（aroma extract dilutionanalysis，AEDA）、稳定同位素稀释分析（stable isotope dilution analysis，SIDA）等技术的相互结合，对食品中关键气味活性化合物进行准确地定性定量及重要性排序[33]。以对茶叶香气物质进行分析为例，通过GC-O对不同梯度稀释样品进行嗅闻，对每一种气味化合物进行风味稀释因子（FD）的测定，具有更高FD因子的挥发性物质，通常被认为对茶叶整体香气具有更高的贡献度，该技术将仪器分析结果与研究人员对茶叶香气的感知结果结合起来，最终可对茶叶香气物质进行全面而准确地评价，径山茶的研究就是其中的典型代表。随后，还可进行香气重组与缺失实验，筛选出与茶叶香气轮廓非常相似的香气重组物，以此来对茶叶样品整体风味中起到关键作用的挥发性物质进行验证。而在以其他农作物为材料进行的研究中，Tanja Schaller等人通过溶剂辅助风味蒸发法对来自中国的新鲜生姜与烤姜的挥发性组分进行提取分离鉴定，结合分子感官科学，通过香气提取物稀释分析等手段确定它们的关键香气活性化合物并进行对比，以探究热处理对生姜香气的影响[33]。随后，他们使用稳定同位素稀释法（SIDA）对新鲜生姜和烤姜中挑选出的主要挥发性物质进行准确定量，根据OAV值定位了对目标样品香味贡献度大的挥发性化合物，并通过重组实验对实验结果进行了验证[34]。

对茶叶香气物质进行定量的方法有内标法、标准加入法和稳定同位素稀释分析等方法；其中，稳定同位素稀释分析（SIDA）越来越受研究者群体的青睐。SIDA通过将已知质量和丰度的标记稳定同位素的香气组分加入到样品中，均匀混合，用质谱仪测定混合前后同位素丰度的变化，由此计算出样品中该香气组分含量。由于香气组分在标记稳定同位素前后，其物理和化学性质几乎相同，受基本效应和仪器条件变化的影响较小，其分析结果的准确度与精度较高。但稳定同位素稀释分析技术的成本较高，如何降低实验难度与成本成为该实验技术未来发展方向。

3 总结与展望

茶叶香气的优劣是决定茶叶品质高低的重要因素，是茶的灵魂，其实质是众多挥发性化合物以不同比例组合呈现的结果，这些组合也造就了茶叶复杂迷人的香气。绿茶是我国茶叶市场产出量与消费量最大的茶叶种类，也是我国传统名优茶最集中的茶叶种类，对绿茶香气的研究无论是从学术角度出发还是考虑到整个茶叶市场都是非常必要的。如今，针对不同提取环境或不同目标化合物已开发出多种茶叶香气前处理方法，确保尽可能还原茶叶样品的香气轮廓，同时先进的成分鉴定和分析方法不仅可以实现对绿茶香气品质的感官分析，还可以对挥发性化合物进行定量和定性检测，在探索关键香气活性化合物方面发挥重要作用，也让对各香型绿茶关键香气物质的定位成为可能。

目前，化合物和所感知气味之间的关系还没有很好地建立起来，明确特征性挥发物与感官结果的关系仍是必要的，这对绿茶香气品质研究具有重要意义，也对绿茶的审评与加工层面具有极大的参考价值与指导意义。