不同产地红天麻多酚组成及体外抗氧化活性研究

2021-12-17 02:49蔺蓓蓓苏鹏超周天华张小莺郑红星田慧玲冯振斌
关键词:广元清除率天麻

陈 琛,蔺蓓蓓,苏鹏超,周天华,张小莺,郑红星, 田慧玲,冯振斌,刘 祥

(1 陕西理工大学 中德天然产物研究所/陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心/生物科学与工程学院,陕西 汉中 723000; 2 陕西汉王药业股份有限公司,陕西 汉中723000)

天麻(GastrodiaelataBl.)为兰科天麻属多年生草本植物,常与密环菌共生,是国家三级保护物种,药用部位是块茎[1]。天麻可以息风止痉,平抑肝阳,祛风通络,还具有镇静、催眠、镇痛、增强免疫等作用[2-7],常用于治疗头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫、抽搐、破伤风等病症[8]。天麻的主要成分有天麻素、天麻苷元、多糖、多酚、蛋白等[9]。天麻分为红天麻(天麻原变型)、乌天麻、绿天麻、黄天麻和松天麻5个变型[10],以红天麻、乌天麻变型资源最丰富,天麻素和多糖含量均较高,为栽培的优良品系。特别是红天麻含水率高、生长快,且耐旱适应性强,主产我国黄河及长江流域诸省,遍及全国西南至东北大部分地区[11],其中陕西、四川、云南、贵州等为红天麻道地产区。目前对天麻的研究主要集中在种质资源产地[12-14]、萌发菌与规范化栽培[15-17]、化学成分分析[18-20]、质量分析控制[21-23]、药理作用[24-26]、天麻素和天麻多糖提取制备[27-29]等方面。

多酚是一类多羟基酚类化合物,存在于果蔬和中药材等许多植物中,具有清除活性过氧自由基、延缓衰老、预防心血管疾病、抗癌、抗凝血、抗过敏、抗炎、抑菌等活性[30]。多酚是一种天然抗氧化剂,其在食品、医药、化学及化妆品等领域日益成为关注的研究对象,但关于我国传统道地主流种质资源类型红天麻(GastrodiaelataBl.f.elata)中的多酚类物质比较和抗氧化活性研究目前还鲜有报道。

本试验以陕西汉中、云南昭通、贵州大方、四川广元4个产地的红天麻为原料,提取其中的游离酚和结合酚,并对其体外抗氧化活性进行测定,比较不同产地红天麻游离酚和结合酚的含量、组成及其抗氧化活性,以期为天麻道地性形成研究、资源综合利用及天然抗氧化剂、功能性食品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试4种红天麻分别来源于陕西略阳、云南昭通、贵州大方、四川广元,收集时间为2018年12月,经陕西理工大学王勇博士鉴定保存。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical,DPPH),日本东京化成工业株式会社;多酚标准品,上海诗丹德生物技术有限公司;抗坏血酸(VC),成都科龙化工试剂厂;福林酚试剂,合肥博美生物科技有限公司;没食子酸、 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid) ammonium salt,ABTS),北京索莱宝公司;色谱级乙腈、冰乙酸,美国Sigma公司;二甲基亚砜(DMSO),阿拉丁试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Rotina 420R台式离心机,德国Hettich公司;Allegra 64R型离心机,美国贝克曼库尔特公司;4802S紫外分光光度计,尤尼柯上海仪器有限公司;RV10旋转蒸发仪,德国IKA公司;722G可见分光光度计,上海仪电分析仪器有限公司;真空恒温干燥箱,上海实验仪器厂有限公司;LGJ-10D冷冻干燥机,北京四环科学仪器厂有限公司;Thermo U-300高效液相色谱(UPLC)仪,美国Thermo公司。

1.3 天麻多酚的提取及测定

1.3.1 天麻多酚提取 红天麻粉碎,过孔径250 μm(60目)筛后于4 ℃保存备用。(1)游离酚提取。参考Okarter等[31]的方法但适当修改。称取100 g红天麻干粉,加入2 000 mL 体积分数80%的预冷丙酮溶液,45 ℃、300 W超声辅助提取30 min,再经3 500g离心10 min后取上清液。重复提取2次,合并上清液,经45 ℃减压浓缩后冷冻干燥,-20 ℃保存备用。(2)结合酚提取。参考肖星凝等[32]的方法,收集游离酚提取后的残渣,加入2 000 mL 3 mol/L NaOH搅拌1.5 h,用浓盐酸调pH至 6左右。加入正己烷搅拌10 min后离心,除去脂肪层。加入乙酸乙酯充分搅拌10 min,3 500g离心10 min,重复提取2次,合并上清液,经45 ℃减压浓缩后冷冻干燥,-20 ℃保存备用。

1.3.2 多酚含量测定 参考Chen等[33]的方法,配制1 mg/mL的没食子酸溶液10 mL,然后梯度稀释成质量浓度分别为0,20,40,60,80,100,120和140 μg/mL的没食子酸标准溶液。取上述标准液各200 μL,依次加入800 μL去离子水、200 μL福林酚试剂,充分摇匀,避光6 min,再加入2 mL质量分数7%碳酸钠溶液和1.6 mL去离子水,1.5 h后在760 nm测吸光度,以没食子酸质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线[34]。标准曲线方程为:y=0.006 1x-0.004(式中,y表示吸光度,x表示没食子酸质量浓度(μg/mL)),R2=0.997 0。根据该方程计算待测样品中的多酚含量,即将测出的未知样品的OD760 nm值带入方程中,计算样品的没食子酸质量浓度,结果用每克天麻干粉中所含的没食子酸当量(mg/g)表示。

1.3.3 UPLC测定 参照本实验室前期已经建立的方法[35],将天麻多酚组分在Thermo U-300高效液相色谱仪上进行UPLC分析,该系统由四元泵、自动进样器、柱温箱、样品盘和紫外线检测器组成。色谱柱:Inertsil/WondaSil C18(250 mm×4.6 mm,4 μm),流动相为乙腈(A)和质量分数0.2%冰乙酸(B),检测波长为280 nm和254 nm,柱温25 ℃。梯度洗脱条件:0~15 min,5%~6% A,其余为B(下同);15~30 min,6%~30% A;30~35 min,30%~45% A;35~45 min,45%~65% A;流速0.8 mL/min;进样量10 μL;每个样品平行测定3次。

1.4 天麻多酚抗氧化活性的测定

1.4.1 DPPH自由基清除能力 配制140 μg/mL DPPH溶液和质量浓度为2,4,6,8,10 mg/mL的红天麻多酚样品溶液各10 mL,将150 μL DPPH溶液与50 μL天麻多酚溶液于96孔板中混合均匀作为试验组,用无水乙醇代替DPPH溶液作为样品的背景,用DMSO代替天麻多酚溶液作为空白对照,在515 nm处测定吸光值,以VC作为阳性对照。通过式(1)计算样品对DPPH自由基的清除率[36]:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)]/Ac×100%。

(1)

式中:Ai为试验组的吸光度,Aj为样品背景的吸光度,Ac为空白对照的吸光度。

1.4.2 羟自由基清除能力 分别配制质量浓度为2,4,6,8,10 mg/mL的红天麻多酚溶液 500 μL,加入1 mL 9 mmol/L FeSO4,1 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇,最后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2启动反应,室温下保持30 min后测定510 nm下的吸光度,以VC为阳性对照,用水代替H2O2溶液作为样品的背景,用DMSO代替红天麻多酚溶液作为空白对照。按式(2)计算样品对羟自由基的清除率[37]:

羟自由基清除率(%)=(1-(As-Ax))/A0×100%。

(2)

式中:As为试验组的吸光度,Ax为样品背景的吸光度,A0为空白对照的吸光度。

1.4.3 ABTS自由基清除能力 配制7 mmol/L的ABTS(蒸馏水溶解)溶液30 mL,加入140 mmol/L过硫酸钾水溶液0.528 mL,充分混匀,室温避光放置12~16 h,然后用无水乙醇稀释,将吸光度调整至0.700±0.02,即为ABTS工作液,避光保存备用[38]。试验组取100 μL红天麻多酚溶液与3.0 mL ABTS工作液混匀,在25 ℃作用30 min,用酶标仪在734 nm波长处测定吸光度,DMSO代替红天麻多酚溶液作为空白对照,无水乙醇代替ABTS工作液作为样品的背景,以VC作为阳性对照。ABTS自由基清除率的计算公式为:

ABTS自由基清除率(%)=(1-(A-Ab))/

Aa×100%。

(3)

式中:A为试验组测得的吸光度,Ab为样品背景的吸光度,Aa为空白对照的吸光度。

1.5 数据处理

每项试验均重复3 次,结果以“平均值±标准差”表示。采用Excel、SPSS软件对试验数据进行分析处理并绘图。使用抗氧化活性综合(antioxidant potency composite,APC)指数法对不同产地红天麻游离酚和结合酚清除DPPH自由基、羟自由基、ABTS自由基的能力进行系统的综合评价。APC指数的计算公式为:

(4)

式中:APC指数指各样品3种方法(清除DPPH自由基、羟自由基和ABTS自由基)抗氧化活性指数(antioxidant potency index,API)的均值;API指各样品3种方法的抗氧化活性指数(API=每种方法中每个样品的清除率/每种方法中样本清除率的最大值);n指抗氧化活性测定采用的方法数量,为3,即指清除DPPH、羟自由基和ABTS自由基这3种方法。

2 结果与分析

2.1 不同产地红天麻多酚含量的比较

由表1可知,4个不同产地红天麻游离酚含量为371.57~442.62 μg/g,表现为陕西汉中>贵州大方>云南昭通>四川广元;结合酚含量为65.34~83.10 μg/g,表现为陕西汉中>云南昭通>贵州大方>四川广元;总多酚含量为436.91~525.72 μg/g,表现为陕西汉中>贵州大方>云南昭通>四川广元;4个不同产地红天麻的总多酚平均含量为436.91 μg/g,该结果与Zhan等[3]的报道一致。游离酚占总多酚含量的84.3%以上,约为结合酚的5.4倍,可见游离酚是红天麻多酚的主要存在形式。陕西汉中红天麻的总多酚含量最高,云南昭通与贵州大方红天麻总多酚含量无显著差异,但均显著高于四川广元红天麻(P<0.05)。

表1 4个产地红天麻游离酚、结合酚与总多酚含量的比较Table 1 Contents of free,bound and total phenolics in G.elata Bl. f. elata from four habitats μg/g

2.2 不同产地红天麻多酚组成成分分析

用超高效液相色谱法得到14种多酚物质标准品的色谱图见图1,其回归方程见表2。

1.没食子酸;2.原儿茶酸;3.对羟基苯甲酸;4.儿茶素;5.绿原酸;6.咖啡酸;7.表儿茶素;8.荭草素;9.芦丁;10.阿魏酸; 11.苯甲酸;12.白藜芦醇;13.槲皮素;14.肉桂酸。图2同1.Gallic acid;2.Protocatechuic acid;3.p-Hydroxybenzoic acid;4.Catechin;5.Chlorogenic acid;6.Caffeic acid;7.Epicatechin;8.Orientin; 9.Rutin;10.Ferulic acid;11.Benzoic acid;12.Resveratrol;13.Quercetin;14.Cinnamic acid.Fig.2 is the same图1 14种多酚标准品超高效液相色谱图Fig.1 Ultra performance liquid chromatograms of 14 polyphenol standards

标准品 Standard 保留时间/minRetention time回归方程Regression equation相关系数Correlation coefficient没食子酸Gallic acid7.360y=21.513x-0.003 10.999 3原儿茶酸Protocatechuic acid15.413y=40.415x+0.003 50.999 9对羟基苯甲酸p-Hydroxybenzoic acid23.670y=125.83x-0.001 20.999 9儿茶素Catechin25.070y=7.566 2x-0.000 80.999 7绿原酸Chlorogenic acid26.187y=21.776x+0.036 50.996 3咖啡酸Caffeic acid26.647y=22.262x-0.009 60.991 9表儿茶素Epicatechin27.167y=7.075 4x-0.001 00.999 7荭草素Orientin28.767y=10.909x-0.019 70.995 0芦丁Rutin29.817y=22.227x-0.006 60.999 0阿魏酸Ferulic acid31.287y=56.35x+0.001 10.999 9苯甲酸Benzoic acid33.247y=7.418 3x+0.002 40.999 6白藜芦醇Resveratrol35.810y=28.313x-0.000 50.995 7槲皮素Quercetin37.057y=5.641 1x-0.027 00.980 9肉桂酸Cinnamic acid37.670y=125.62x+0.000 61.000 0

根据图1和表2分析计算得到4个产地红天麻游离酚、结合酚中多酚组成成分及含量见表3。红天麻中游离酚和结合酚分析检测的代表性色谱图见图2。

表3 4个产地红天麻游离酚、结合酚中多酚组成成分及其含量Table 3 Polyphenol composition and contents of free and bound phenols in G.elata Bl. f. elata from four habitats μg/g

由表3可知,4个不同产地红天麻的多酚种类均较为丰富,游离酚主要由表儿茶素、荭草素、咖啡酸、没食子酸、肉桂酸组成,结合酚主要由表儿茶素、肉桂酸组成。4个不同产地天麻游离酚中,均以荭草素含量最高,其中云南昭通红天麻为187.40 μg/g、四川广元为98.94 μg/g、贵州大方为90.86 μg/g、陕西汉中为86.51 μg/g;白藜芦醇含量最低,只在陕西汉中红天麻中检测到,含量仅为1.26 μg/g。结合酚组分中,各产地均以表儿茶素含量最高,其中四川广元为33.07 μg/g、云南昭通为23.82 μg/g、陕西汉中为18.62 μg/g、贵州大方为5.18 μg/g;咖啡酸含量最低,为0.05 μg/g,且仅在贵州大方结合酚中检测到。4个不同产地红天麻结合酚和游离酚中的多酚种类和含量存在较大差异,其中表儿茶素和肉桂酸在每个产地的游离酚和结合酚中都存在,但表儿茶素含量较高,最高含量为46.49 μg/g,肉桂酸含量最高的为4.52 μg/g。

图2 4个产地红天麻游离酚(A)和结合酚(B)的UPLC分析Fig.2 Chromatograms of free phenol (A) and bound phenol (B) in G. elata Bl. f. elata from four habitats

2.3 不同产地红天麻多酚DPPH自由基清除能力的比较

由图3可知,4个不同产地红天麻多酚均具有一定的DPPH自由基清除能力,且清除能力随质量浓度的增大而有所增强,陕西汉中、云南昭通和四川广元红天麻游离酚对DPPH自由基的清除率在最高质量浓度10 mg/mL下均低于50%;贵州大方红天麻游离酚的DPPH自由基清除率最高,其IC50(达到50%抑制效果时的质量浓度)为1.35 mg/mL(表4)。就结合酚而言,4个不同产地红天麻结合酚对DPPH自由基的清除能力均较强,在质量浓度为6 mg/mL时,贵州大方红天麻结合酚对DPPH自由基的清除率达到了98.99%。

2.4 不同产地红天麻多酚羟自由基清除能力的比较

由图4可知,4个不同产地红天麻多酚对羟自由基均具有一定的清除能力,相同质量浓度下红天麻游离酚的羟自由基清除能力明显弱于结合酚,游离酚和结合酚的抗氧化活性均弱于VC。由图4还可知,4个产地红天麻多酚对羟自由基的清除能力均随多酚质量浓度的增大而增强。各质量浓度游离酚对羟自由基的清除率均低于50%,结合酚在10 mg/mL时的羟自由基清除率均高于50%,其中贵州大方红天麻结合酚对羟自由基的清除力最强,其IC50为2.65 mg/mL(表5)。

图3 4个产地红天麻游离酚(A)和结合酚(B)DPPH自由基清除率的比较Fig.3 Comparison of DPPH free radical scavenging rates of free phenol (A) and bound phenol (B) in G. elata Bl. f. elata from four habitats

产地HabitatIC50/(mg·mL-1) 游离酚Free phenolic结合酚Bound phenolic产地HabitatIC50/(mg·mL-1) 游离酚Free phenolic结合酚Bound phenolic陕西汉中 Hanzhong,Shaanxi8.61±0.32 b2.45±0.10 b贵州大方 Dafang,Guizhou1.35±0.20 c1.44±0.10 c云南昭通 Zhaotong,Yunnan9.33±0.79 b8.98±0.51 a四川广元 Guangyuan,Sichuan12.93±0.64 a9.62±0.57 a

图4 4个产地红天麻游离酚(A)和结合酚(B)羟自由基清除率的比较Fig.4 Comparison of hydroxyl radical scavenging capacity of free phenol (A) and bound phenol (B) in G.elata Bl. f. elata from four habitats

产地HabitatIC50/(mg·mL-1) 游离酚Free phenolic结合酚Bound phenolic产地HabitatIC50/(mg·mL-1) 游离酚Free phenolic结合酚Bound phenolic陕西汉中Hanzhong,Shaanxi-7.29±0.96 a贵州大方Dafang,Guizhou9.99±0.01 c2.65±0.56 c云南昭通Zhaotong,Yunnan12.48±0.94 b6.45±0.02 b四川广元Guangyuan,Sichuan28.58±9.13 a7.66±0.76 a

2.5 不同产地红天麻多酚ABTS自由基清除能力的比较

由图5可知,4个不同产地红天麻多酚均具有一定的ABTS自由基清除能力,相同质量浓度下游离酚对ABTS自由基的清除能力明显弱于结合酚,游离酚和结合酚抗氧化能力均弱于VC。4个产地红天麻多酚对ABTS自由基的清除能力均随质量浓度的增大而增强,游离酚对ABTS自由基的清除率在最高浓度下在55%~75%,其中云南昭通红天麻游离酚对ABTS自由基的清除率最高,为73.55%,其IC50为3.75 mg/mL(表6);贵州大方红天麻游离酚对ABTS自由基的清除率最低,其IC50为7.11 mg/mL。结合酚清除ABTS自由基活性较好,在质量浓度为8 mg/mL时,贵州大方红天麻结合酚对ABTS自由基清除率达96.93%,其IC50为1.01 mg/mL。

图5 4个产地红天麻游离酚(A)和结合酚(B) ABTS自由基清除率的比较Fig.5 Comparison of ABTS+ radical scavenging capacity of free phenol (A) and bound phenol (B) in G.elata Bl. f. elata from four habitats

产地HabitatIC50/(mg·mL-1) 游离酚Free phenolic结合酚Bound phenolic产地HabitatIC50/(mg·mL-1) 游离酚Free phenolic结合酚Bound phenolic陕西汉中Hanzhong,Shaanxi6.74±0.41 a2.69±0.31 c贵州大方Dafang,Guizhou7.11±0.49 a1.01±0.01 d云南昭通Zhaotong,Yunnan3.75±0.46 c3.05±0.23 b四川广元Guangyuan,Sichuan5.54±0.50 b3.64±0.50 a

2.6 不同产地红天麻多酚抗氧化活性的综合评价

采用3种不同方法检测红天麻多酚的抗氧化活性,并采用APC指数综合评价[39]其多酚的抗氧化能力,结果(表7)表明,VC和不同产地红天麻游离酚APC指数大小依次为VC(98.81%)>云南昭通(57.48%)>贵州大方(48.18%)>四川广元(44.91%)>陕西汉中(44.65%);结合酚APC指数大小依次为VC(98.81%)>贵州大方(96.04%)>陕西汉中(74.91%)>云南昭通(65.30%)>四川广元(62.55%)。

可见,不同产地红天麻游离酚的APC指数均明显低于结合酚,其中贵州大方红天麻结合酚的APC指数最高,为96.04%,由此可知贵州大方红天麻结合酚的综合抗氧化活性最强;陕西汉中红天麻结合酚的APC指数为74.91%,抗氧化活性次之。

3 讨论与结论

天麻中富含天麻素、天麻苷元、多糖、多酚、蛋白等活性物质,具有多种生物活性。本研究结果显示,4个产地红天麻平均总多酚含量为486.27 μg/g,其中以陕西汉中红天麻的总多酚含量最高,为525.72 μg/g;四川广元红天麻总多酚含量最低,为436.91 μg/g。4个产地红天麻游离酚含量为371.57~442.62 μg/g,结合酚含量为65.34~83.10 μg/g。本研究中天麻平均总多酚含量高于蔺蓓蓓等[40]检测的天麻多酚含量(257.48 μg/g),可能是提取方法不同所致。本研究采用多次重复提取,游离酚、结合酚分别提取,因此导致总多酚含量较高。

表7 4个产地红天麻多酚抗氧化活性的综合评价Table 7 Comprehensive evaluation of antioxidant activity of phenol in G.elata Bl. f. elata from four habitats

通过UPLC分析了多酚种类及含量,游离酚主要有表儿茶素、荭草素、咖啡酸、没食子酸和肉桂酸,结合酚主要有表儿茶素、肉桂酸。前期对天麻水提物中多酚的研究[41]中,检测到对羟基苯甲酸、儿茶素、咖啡酸、表儿茶素、荭草素、槲皮素、肉桂酸,本研究虽未检测到槲皮素,但是与前期相比,检测到了没食子酸、绿原酸、阿魏酸和白藜芦醇,这可能是提取方法不同导致的差异。

利用清除DPPH·、ABTS+·和·OH这3种抗氧化方法评价4个产地红天麻游离酚和结合酚的抗氧化能力,得到红天麻游离酚和结合酚抗氧化活性的综合评价结果(APC指数)为:VC>贵州大方结合酚>陕西汉中结合酚>云南昭通结合酚>四川广元结合酚>云南昭通游离酚>贵州大方游离酚>四川广元游离酚>陕西汉中游离酚,表明4种红天麻多酚种类丰富,且均具有较强的抗氧化活性,这为其进一步研究开发提供了基础数据。

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