进料负荷对牛粪玉米秸秆混合厌氧发酵效果的影响

庞震鹏，李永平，朱教宁，汤 昀，王秀红，史向远，郭常莲

（1.山西农业大学山西有机旱作农业研究院，山西太原030031；2.山西省农业科学院现代农业研究中心，山西太原030031；3.山西农业大学研究生院，山西太原030031）

我国畜禽粪便排放量每年可达26亿t[1]，造成大气、水源、土地污染并严重影响当地居民的生活质量和生命健康[2-3]。利用农业废弃物进行混合厌氧发酵生产沼气是实现其资源化利用的重要手段之一[4-5]，厌氧发酵过程产物沼气可用于新能源利用，厌氧发酵的末端产物沼液沼渣可用于生产有机肥。通过探究混合厌氧发酵适宜的工艺可充分利用物料的理化特性，在提升产气效率的同时，进一步提升原料转化率，充分实现农业废弃物高效增值利用。桂伦等[6]研究结果表明，进料干物质（TS）质量分数低于12%时可降低中温条件下厌氧发酵中的氨抑制，保证工程稳定运行。李云芳等[7]的研究结果表明，牛粪和秸秆的配比为1∶3时甲烷产量达3.94L/d，比纯牛粪发酵产出高23.67%；王世伟等[8]研究认为，中温条件牛粪秸秆厌氧发酵的最佳产气条件为温度25℃，TS为17.6%时产气效果较好。王粟等[9]的研究表明，经响应面法优化，当发酵温度为41℃、总固体浓度为8.9%、生物炭添加量为7.9%时，生物炭与牛粪混合厌氧发酵产气量达2 735 mL，接近优化值。李永平等[10]的研究结果表明，牛粪玉米秸秆干物质质量比为2∶8时，甲烷总产量高于其他处理。朱教宁等[11]的研究结果表明，进料量对农业废弃物半连续厌氧发酵体系稳定性有显著影响，当进料量为160 g/L时系统出现酸累积。上述研究多关注于温度、配比等发酵初始因素对系统产沼气效果的影响，而沼气工程运行因受连续进出料量操作的影响，发酵罐中料液环境极易受到氨氮、挥发性脂肪酸等浓度变化形成的冲击，造成产气失衡。已有研究在进料负荷对混合厌氧发酵产甲烷及系统稳定性影响方面缺乏综合研究，难以对沼气工程的稳定运行提供技术指导。

本研究以10 L温控发酵装置为反应器，模拟沼气工程连续进出料过程，在不同日进料负荷条件下探究混合厌氧发酵产甲烷效果的规律及发酵过程中生化指标的动态趋势，分析理化因子对系统稳定性的影响，优化确定适宜的日进料负荷，以期在保证沼气工程稳定运行的情况下，达到成本节约、提升效率的目的，为牛粪玉米秸秆混合厌氧发酵模式提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究选择的试验用发酵物料为牛粪和玉米秸秆。牛粪取自山西省晋中市东阳镇某奶牛养殖场，取样均匀不含砂石等杂质。玉米秸秆取自山西农业大学（山西省农业科学院）东阳试验示范实习实训基地玉米田，经晾晒干燥后用粉碎机打磨成3～5 mm的颗粒。接种物取自山西农业大学（山西省农业科学院）东阳试验示范实习实训基地正常运行60 d以上沼气池中的沼液，带回实验室后在（35±1）℃恒温条件下驯化7 d，丰富沼液中菌群数量。各发酵物料理化性质如表1所示。

表1 厌氧发酵物料性质

1.2 试验方法

以10 L自动温控厌氧发酵罐为反应容器，试验装置如图1所示。反应器的总体积为10 L，通过配备的恒温循环水浴加热装置可保持发酵料液温度恒定。牛粪与玉米秸秆挥发性固体量（VS）质量比为1∶1的混合物作为发酵原料，为了有助于料液均质及进出料操作，本研究的混合原料总挥发性固体质量分数不宜设置较高，故确定发酵料液VS质量分数为6%，各处理反应器内每日料液总体积维持在7.5 L，接种量（以VS计）为20%。依据前期研究，10 L发酵系统的日产气量在20 d前后下降明显，因此，适宜的水力滞留时间（HRT）为20 d左右，按HRT为17、20、23、26 d分别以挥发性固体质量投入量设1.85（T1）、1.58（T2）、1.37（T3）、1.21（T4）g/（L·d）4个进料负荷水平。试验阶段，每日固定时间按不同处理的进料负荷分别向各处理投料并取出体积相同的料液，连续进行发酵产气。设置发酵温度（35±1）℃，搅拌强度50 r/min，搅拌时长30 min/次，单次搅拌时长12 h。测定各处理产气指标，分析料液挥发性脂肪酸（VFAs）、碱度、氨氮及化学需氧量（COD）等理化指标。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 理化指标的测定 将牛粪、玉米秸秆和接种物均质后取样置于恒温鼓风干燥箱中，设置温度为105℃，采用差重法[11]计算干物质含量。

将烘干样置于马弗炉中600℃下灼烧，得到灰分，采用差重法计算挥发性固体含量。

总有机碳（TOC）、总氮（TN）测定参照NY/T 525—2021执行，TOC采用重铬酸钾外加热法测定，TN采用H2SO4-H2O2消煮-凯氏定氮法测定。

碱度、挥发性脂肪酸、化学需氧量、氨氮等指标均取沼液上清液（出料料液经5 000 r/min条件下离心15 min）测定。碱度采用电位滴定仪测定。挥发性脂肪酸（VFAs）采用比色法[12]测定。化学需氧量（COD）按照GB/T 11914—1989水质化学需氧量测定（重铬酸钾法）方法测定。氨氮按照HJ 537—2009水质氨氮的测定（蒸馏—中和滴定法）方法测定，上述指标均3 d测定1次。

1.3.2 产气指标的测定 日产甲烷量采用排水法测定日产气量[13]，日产气量乘以每日沼气中甲烷含量即为日产甲烷量。沼气成分测定：使用铝箔气体采样袋收集每日各试验处理产生的气体，采用安捷伦7890B气相色谱仪对气体成分进行测定，色谱条件为：色谱柱HP-INNOWAX（60 μm×530 μm×1 μm），载气为氢气，流量5 mL/min，压强0.05 Mpa，平均线速度35.701 cm/s，滞留时间2.80 min；TCD检测器：温度250℃，参比流量40 mL/min，尾吹气流量（H2）2 mL/min。

1.4 数据处理

采用SPSS 17.0软件对试验数据进行处理，利用Excel 2010软件制作并编辑图表。

2 结果与分析

2.1 不同进料负荷对混合厌氧发酵产甲烷效果的影响

2.1.1 日产甲烷量 日产甲烷量是发酵系统每日产出沼气中甲烷的体积，厌氧发酵系统进入产气稳定期后，日产甲烷量变化幅度较小，产甲烷量较均匀。从图2可以看出，不同进料负荷对牛粪和玉米秸秆混合厌氧发酵日产甲烷量影响的变化规律除T4为缓慢升高至平缓外，其他处理均为先升后降、再升高至平缓。T1、T2、T4处理的产甲烷量在发酵第4天才开始出现小幅下降，T3处理在发酵第3天后即出现下降现象。T1处理的产甲烷峰值出现在第11天，峰值为3.08 L；T2处理的产气峰值出现在第9天，峰值为3.17 L；T3处理的产气峰值出现在第12天，峰值为3.11 L，T4处理的产气峰值出现在第11天，峰值为2.44 L。各处理日产甲烷量均在发酵13 d后趋于稳定。T4处理在稳定后产甲烷量明显低于其他处理，原因可能是每日新加入物料较少，微生物可有效利用的有机质相对减少，限制了水解菌的繁殖速度和水解活力，最终造成产甲烷菌所需底物减少，表现为产甲烷能力降低。综合各处理日产甲烷量变化趋势，T2处理的日产甲烷量峰值早于其他处理，且峰值产量高于其他处理，分别比T1、T3和T4处理高2.92%、1.93%和29.92%，表明T2处理的进料负荷使发酵系统更快地进入到产甲烷高峰阶段，利于产气进行。

2.1.2 产甲烷总量 从图3可以看出，4个处理产甲烷总量由高到低排序为T1＞T2＞T3＞T4，其中，T1处理与T2处理间差异不显著，T1、T2处理分别与T3、T4处理间差异显著（P＜0.05），T3、T4处理间差异显著（P＜0.05）。T1处理产甲烷总量为61.45 L，比T4处理高31.02%；T2处理产甲烷总量为59.16 L，比T4处理高26.14%；T3处理产甲烷总量为54.84 L，比T4处理高16.93%，表明当每日进料负荷降低时，在相同的发酵时间内产甲烷总量随之降低，同时表明每日新鲜物料中有机物含量的高低对产甲烷总量具有较明显的影响。在实际运行中，水力停留时间越小，进料负荷越大，沼气工程设备的运行时间相对较长，因此，在产甲烷总量差异不显著时，尽可能缩短设备运行时间，可以降低运行成本。T2处理下的进料负荷可在高产甲烷量的同时尽可能缩短设备运行时间，降低能耗。

2.1.3挥发性固体产甲烷量（VS产甲烷量）VS产甲烷量表示进料物料中每单位有机质被微生物分解利用所产生的甲烷量，一般用L/g表示。VS产甲烷量越高表示物料的发酵潜力越大，单位有机质可产生的甲烷气体越多。由表2可知，T1～T4处理随着进料负荷的减少，VS产甲烷量先增后减，T1处理与T2、T3、T4处理间差异显著（P＜0.05）；T2处理与T3、T4处理间差异均不显著；T3、T4处理间差异也不显著。T1处理的产甲烷总量较高但VS产甲烷量较低，T2、T3、T4处理反之，原因可能是每日单次投入的物料较多时，在下一次出料前体系内的新物料并没有被充分分解利用，部分未参与反应的物料在出料时被排出，造成一定的有机质损失。选择T2处理的进料负荷量可在保证较高产气效率、提升原料利用率的同时，最大程度地增加畜禽粪污等农业废弃物的处理量。

表2 不同进料负荷对混合厌氧发酵VS产甲烷量的影响

2.2 不同进料负荷对混合厌氧发酵体系理化指标的影响

每日进料负荷由于有机质含量和比例的不同，对厌氧发酵系统中微生物的生长速率和生理活性具有重要作用，进而进一步影响发酵系统的稳定性，进料负荷过高，系统易出现氨氮累积或酸化；进料负荷过低，系统养分不足，最终均会影响产甲烷量[14-16]。系统稳定性变化主要表现为发酵过程中理化指标的变化，如挥发性脂肪酸、碱度及氨氮等。

2.2.1 挥发性脂肪酸（VFAs）VFAs是水解微生物分解物料有机质的产物，产甲烷菌利用VFAs作为底物进一步生产甲烷。VFAs浓度过高，发酵系统易酸化，各类水解菌和产甲烷菌等微生物活性降低，导致系统产气降低；VFAs浓度过低，产甲烷阶段又无法保证足够的底物，产气也会降低[17]，因此，适宜浓度的VFAs对保持系统稳定性具有重要作用。从图4可以看出，T2、T3处理VFAs质量浓度在第6天达到首个峰值，VFAs质量浓度分别为1 033.51、1 112.30 mg/L；T1、T4处理VFAs质量浓度在第9天达到首个峰值，VFAs质量浓度分别为844.81、779.71 mg/L。发酵6 d后，T2和T3处理的VFAs质量浓度开始下降；发酵9 d后，T1和T4处理的VFAs质量浓度开始下降，各处理均在第12天达到低谷，此后VFAs质量浓度又逐渐升高，T3和T4处理分别在18、22 d又出现下降现象，系统VFAs出现波动性的原因可能是随着不间断的进出料过程，VFAs不断的产生、被消耗，达到一种波动式的动态平衡。可以发现，不同进料负荷对水解微生物的产酸阶段有一定的影响，但过多的进料和过少的进料都会延缓VFAs质量浓度峰值出现的时间，且VFAs峰值质量浓度相对较低，与T1、T4处理相比，T2、T3处理的VFAs质量浓度峰值出现的时间更短，VFAs质量浓度更高，T2处理于整个发酵过程VFAs质量浓度变化波动幅度最小，表明T2处理的进料负荷更有利于促进发酵阶段的产酸，可以缩短非产甲烷阶段的时间，进而延长产甲烷阶段时间。

2.2.2 碱度 碱度对发酵过程中出现的过酸过碱现象具有重要矫正作用，是衡量发酵体系缓冲能力的指标，碱度可以预示体系稳定性和厌氧发酵潜在失败可能性[18]。当碱度为3 000～8 500 mg/L且碱度/VFAs的值大于2时，厌氧发酵过程产气较为稳定[18]。由图5可知，不同处理碱度的变化趋势近似，且整个发酵期碱度数值均在3 000 mg/L以上变化。由图6可知，各处理碱度与VFAs的比值均达到2以上，表明不同进料量下各系统的缓冲能力较强，可以持续中和发酵过程中产生的高VFAs抑制，使pH值保持较平稳状态。各处理除T2处理变化较平缓外，其他处理碱度/VFAs值均在发酵第12天大幅提升，此后迅速下降，系统的缓冲能力也逐步由强变弱，原因可能是与T1、T3、T4处理中的VFAs浓度变化波动较大，影响了系统碱度对抗过酸过碱的缓冲能力。T2处理发酵过程碱度值维持在3 000 mg/L以上，碱度/VFAs＞2且较其他处理比值波动小，表明此进料负荷下发酵系统对抗过酸过碱的能力优于其他处理。

2.2.3 氨氮 发酵原料牛粪中含有较高含量（约12%）的粗蛋白[19]，粗蛋白中有机氮会随着厌氧消化的进行最终被转化为氨氮物质。适宜浓度的氨氮一方面可作为微生物的氮素营养来源，一方面能为产甲烷菌生存环境提供一定的缓冲能力，进而维持系统稳定。高浓度氨氮会对微生物产生强烈抑制作用，抑制甲烷的合成[14]。一般认为，氨氮质量浓度为50～200 mg/L时利于厌氧消化；200～1 500 mg/L时对系统无明显拮抗作用；1 500～3 000 mg/L时产甲烷菌活性会受到较大抑制[20]。从图7可以看出，各处理发酵过程的氨氮浓度均未达到抑制浓度（1500～3000 mg/L），且随发酵天数的延长呈下降趋势，这可能是添加了适宜量的玉米秸秆，使得物料C/N较为适宜，体系氨氮浓度趋于均衡，水解微生物和产甲烷微生物的平衡增殖保证了厌氧消化系统有机组分的供需平衡，且在每日投入物料浓度较低的情况下，水解微生物在利用含氮有机物时不会短时间内转化大量NH4+而导致系统出现较高浓度氨氮累积。随着厌氧发酵时间延长，即使每日按时补充新鲜物料，氨氮的整体趋势也在不断下降，发酵12 d后，各处理氨氮浓度下降速率由高到低依次为T1＞T2＞T3＞T4，越接近发酵后期，氨氮浓度越低，表明发酵体系中有害物质堆积越少，越有利于后端产物沼液的无害化利用。T1、T2处理的进料量在发酵中期（12 d）后氨氮浓度较T3、T4处理下降更快，表明系统中的有害物质残留更少，有利于沼液的二次处理。

2.2.4 化学需氧量（COD）COD是衡量物料中有机物的重要指标之一。有机质含量的高低对于总产甲烷量有重要影响，在C/N适宜的情况下，COD含量越高有机质越多，作为发酵底物被微生物利用产生的沼气就越多。从图8可以看出，各处理发酵过程COD浓度总的变化规律为“升高—降低—升高—降低”。各处理第6天达到首个COD浓度峰值，其中T2处理最高，为4 165.7 mg/L，表明在发酵前6 d是水解阶段的活跃期，水解微生物迅速增殖并将物料中有机成分水解释放到料液中，结合日产气量变化，发酵第6～9天同样是日产气量首个峰值出现的时间，表明6～9 d为产甲烷微生物的活跃阶段，产甲烷微生物快速消耗水解菌的代谢产物用以产生沼气。此后由于新鲜物料投加，水解阶段再度活跃，料液中COD浓度再次升高，达到第2个峰值后又进入产甲烷的活跃阶段，如此循环。不同进料负荷对料液中COD浓度变化的影响是显著的，每个变化周期内COD浓度的峰值高低均不相同，发酵第6天峰值由高到低依次为T2＞T4＞T3＞T1；第12天峰值由高到低依次为T2＞T4＞T1＞T3；第18天峰值由高到低依次为T2＞T3＞T4＞T1，各峰值处T2处理均为最高，可见以T2处理作为适宜进料负荷时，系统中微生物利用新鲜有机物料进行生化反应的效率较高，在水解优势阶段释放到料液中的有机组分较多，能够为产甲烷阶段提供较多的底物。

3 讨论

3.1 进料负荷对混合厌氧发酵产气效果评价

在非连续进出料发酵模式中，系统的初始pH、温度及不同物料的混合比等因素对发酵产甲烷的影响作用较大。王勇等[21]的研究结果表明，通过初始pH和发酵温度的优化控制可提升产氢微生物的利用效率，进一步提高系统稳定性；汤昀等[22]探究了不同物料配比对鸡粪玉米秸秆厌氧发酵产气影响，结果表明，鸡粪秸秆比为6∶4时可有效提升混合发酵产气效率。因此，在非连续进出料发酵模式中，产气量及系统稳定性易受发酵初始因素控制。而在连续进出料发酵模式中，系统需要不断重复进出料过程，发酵过程中pH、温度等因素的环境平衡容易被打破，相对非连续进出料发酵模式更容易出现产气不稳定的情况，进料负荷的不同将直接影响发酵系统中微生物因系统有机物浓度变化而产生的生化反应改变。本研究中，随着日进料负荷的降低，产甲烷总量整体呈下降趋势，但在1.58 g/（L·d）进料负荷基础上继续增加物料量产甲烷总量没有显著提高，但相比低于此量的进料负荷提升显著，表明该进料负荷可在保证较高产甲烷量的情况下尽可能减少物料的投入和排出，对沼气工程而言具有降低运行成本的效果。本研究中，混合发酵体系在1.58 g/（L·d）进料负荷下可保持较高产甲烷效果的原因可能是新鲜物料中有机质的补充量与发酵系统微生物水解阶段消耗的有机质量相对一致，微生物菌群能够适应新鲜物料投入后对体系稳态环境的破坏和冲击作用。通过日产甲烷量变化发现，在T2处理发酵第7天至发酵后期，日产甲烷量保持相对稳定，没有明显的数值波动，同样表明产甲烷微生物可以适应进出料对系统的冲击作用。

3.2 进料负荷对混合厌氧发酵体系VFAs浓度变化影响

不同进料负荷通过影响发酵系统的稳定性间接控制产甲烷量的高低，稳定性对沼气工程的正常运行具有十分重要的作用，挥发性脂肪酸浓度变化、碱度变化及COD转化均会影响系统的稳定性。本研究中不同进料负荷对各处理VFAs浓度的变化趋势影响明显，VFAs是厌氧发酵产气过程中重要的中间产物，VFAs的大量累积会引发发酵系统的酸化，虽然pH在合理的区间内，但微生物的生化活动受到抑制，长期刺激会导致微生物菌群各项反应失活，最终导致反应器运行失败[23]。本研究中在发酵周期内VFAs浓度呈现明显的波动变化，随进料负荷的不同呈现不同的波动趋势，T2处理较其他处理的波动幅度较小，发酵第9天后VFAs浓度基本稳定在800 mg/L左右，原因可能是随着进出料的不断进行，水解产酸菌产出VFAs的速率与产甲烷菌利用VFAs的速率接近平缓，VFAs呈现稳定现象。对比其他处理，增加日进料负荷或减少日进料负荷，VFAs浓度均出现较大幅度的波动，发酵中期出现有机酸的过度消耗和累积均不利于产甲烷菌的生化反应，最终表现为产甲烷量少或产甲烷量无显著提升，这与本研究产甲烷总量变化规律一致。随着日进料负荷的增加直至达到1.85 g/（L·d）时，VFAs浓度并没有出现大幅度增加，始终维持在1 200 mg/L以下，所以，本研究最高日进料负荷下未出现酸累积而导致的发酵系统崩溃情况，这与郭建斌等[24]的研究中有机负荷在1.3～4.3 kg/（m3·d）时VFAs未出现酸累积的结果一致。此外，不同进料负荷对发酵体系具有冲击作用影响时，发酵系统中VFAs不能及时转化为甲烷，产氢乙酸菌不能正常降解丁酸、丙酸等时，也是造成VFAs浓度在发酵产气稳定期波动较大的原因[25]，虽然不适宜的进料负荷造成了发酵系统的相对不稳定，但可能只是抑制了产甲烷菌的反应活性，造成产甲烷总量降低或不再明显升高，并没有对发酵系统产生严重的抑制作用。

4 结论

在中温发酵条件下，牛粪玉米秸秆混合厌氧发酵产甲烷总量随日进料负荷的增加而呈上升趋势，VS产甲烷量随日进料负荷的增加而呈下降趋势。当日进料负荷达到1.58 g/（L·d）时，产甲烷总量和VS产甲烷量分别为59.16 L和0.115 L/g，均不再显著增加。T2处理的日进料负荷在保证产甲烷量的情况下，理论上降低了沼气工程运行成本，可以作为牛粪玉米秸秆混合厌氧发酵适宜的日进料负荷量。不同日进料负荷对厌氧发酵过程中碱度及氨氮浓度影响变化的趋势相同，且均在微生物生化活动适宜的范围内变化。对VFAs浓度的变化影响较大，除T2外其他各处理VFAs波动幅度较大，但均在合理范围内变化，没有出现酸累积造成的产气抑制现象。