基于形态指标和转录组的小麦抗旱与耐盐相关性分析

盛雨婷，生林山，陆峻一，赵爱菊，李夕梅

（1.青岛农业大学农学院，山东省旱作技术重点实验室，山东省耐盐作物种质创新与利用工程技术研究中心，山东青岛 266109；2.东营青农大盐碱地高效农业技术产业研究院，山东东营 257000；3.河北省农林科学院粮油作物研究所，河北石家庄 050035）

小麦（Triticum aestivum L.）是我国第二大口粮作物，在保障国家粮食安全方面发挥着重要作用[1]。随着水资源日益短缺和土壤盐渍化日趋严重，小麦生产面临严重威胁[2]。干旱会导致小麦光合能力下降、代谢不均衡，最终抑制小麦生长[3]。盐胁迫会引起小麦细胞离子毒害、光合性能下降、生长发育停滞，严重影响小麦产量[4]。因此，抗旱耐盐小麦新品种的培育对保障小麦生产具有重要意义。

众所周知，抗旱耐盐指标的鉴选对抗旱耐盐品种的选育具有重要指导意义。胚芽鞘长度、茎秆内可溶性碳水化合物、叶片相对含水量、拔节期叶面积指数、根系干质量等形态指标均与小麦抗旱性关系密切[5-9]；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等酶活性、丙二醛（MDA）含量、叶绿素含量及荧光参数、蛋白质和核酸含量、渗透调节能力等生理生化指标也与小麦抗旱性有着较为密切的关系[10-14]。发芽率、发芽势、幼苗存活率、胚芽鞘长、根长、苗高、第一片叶的生长速度、苗鲜质量、春季分蘖数等形态指标可以作为小麦耐盐性鉴定的有效指标[15-17]；K+/Na+比、K+通量、液泡膜和液泡Na+/H+变化、质膜和液泡膜H+-ATPase 活性、细胞膜透性、叶绿素含量、气孔导度、SOD 酶活性、多胺含量、游离脯氨酸含量、羟脯氨酸含量、糖蛋白中糖分含量、甜菜碱含量等生理生化指标也可以作为鉴定小麦耐盐性的重要指标[18-24]。由于小麦抗旱性和耐盐性均是多基因控制的复杂数量性状，在衡量小麦抗旱耐盐性时需要将多种指标结合起来进行综合评定，比如隶属函数法[25]。

小麦旱盐胁迫下形态及生理生化性状的变化都受基因的转录调控，目前，高通量转录组测序技术已广泛应用于植物抗逆相关研究中。LIU 等[26]利用高通量转录组测序发现，14 560 个基因在小麦干旱胁迫前后发生差异表达；ZHANG 等[27]以小麦幼苗根系为研究材料，在全基因组水平上鉴定到36 804 个盐胁迫前后差异表达的基因。

有研究指出，干旱时土壤水分蒸发会导致地表盐分不断积累，使得地表土壤水分减少、盐分浓度增加，因此，干旱和盐害往往同时发生[28]。翁亚伟等[29]研究发现，旱盐复合胁迫下，小麦幼苗的生物量、叶面积、叶绿素荧光和净光合速率等均显著下降；华智锐等[30]研究发现，小麦胚芽鞘长度、发芽势和发芽率均随旱盐交叉胁迫的加剧而呈下降趋势，而SOD、POD 和CAT 活性先上升后下降。目前，旱盐复合胁迫对小麦影响的研究已有报道，但小麦抗旱性与耐盐性相关性的研究尚未见报道。因此，本试验以173 个小麦品种（系）为材料，采用20%PEG溶液（模拟干旱）和150 mmol/L NaCl 溶液（模拟盐害）分别处理种子，并于芽苗期测定其相对胚芽鞘长、相对根长、相对苗高、相对发芽率和相对鲜质量，利用综合隶属函数法计算各品种（系）的抗旱耐盐能力，然后结合高通量转录组数据分析抗旱性与耐盐性的相关性，以期丰富小麦抗旱耐盐性相关研究，为小麦抗旱、耐盐性品种选育提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

青麦6 号、德抗961、济南17、济麦229、鲁麦21、烟农24 等173 份小麦品种（系）[31]用于小麦抗旱耐盐形态鉴定指标数据的测定，抗旱耐盐小麦品种青麦6 号（国审麦2016027）用于旱、盐胁迫的转录组分析。

1.2 基于形态指标的小麦抗旱耐盐相关性分析

小麦材料的萌发与处理、抗旱耐盐形态指标的测定均采用文献[31]的试验方法；然后采用文献[32]的方法计算小麦受胁迫下的相对抗旱或耐盐系数；随后利用Microsoft Excel 2007 对所得相对抗旱（耐盐）系数进行统计分析；再采用隶属函数值进行品种（系）各发芽指标的抗旱和耐盐性综合评定，参考文献[31]进行；最后利用SPSS 22.0 软件计算抗旱性与耐盐性之间的相关系数，参考文献[31]。

1.3 小麦旱、盐胁迫的转录组测序及生物信息学分析

青麦6 号小麦幼苗的培养参考ZHANG 等[27]的方法进行，随后分别采用20%PEG 溶液和0.3%NaCl 溶液对其进行模拟干旱和盐胁迫处理，胁迫发生48 h 后叶片取样并迅速置于液氮中，取出后置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。以正常生长条件的幼苗叶片作对照，每处理3 次生物学重复。RNA 的提取、建库、转录组测序、基因组比对、表达水平分析、GO功能富集分析等均参考ZHANG 等[27]的方法进行。

2 结果与分析

2.1 不同品种（系）小麦抗旱形态指标的统计分析及抗旱性综合评价

从图1 可以看出，旱胁迫下不同小麦品种（系）相对胚芽鞘长、相对根长、相对苗高的隶属函数值主要集中在0～0.49，分别占总数的73.99%、75.72%、99.42%；相对发芽率、相对鲜质量的隶属函数值主要集中在0.30～1.00，分别占总数的91.91%、93.64%。116 个小麦品种（系）（占总数的67.05%）的抗旱性综合隶属函数值在0.30～0.49；分别有27（15.61%）、23 个（13.29%）小麦品种（系）的抗旱性综合隶属函数值在0.20～0.29 和0.50～0.59，二者相差不多；分别只有2（1.16%）、5 个（2.89%）小麦品种（系）的抗旱性综合隶属函数值在0～0.19 和0.60～0.79。

2.2 不同品种（系）小麦耐盐形态指标的统计分析及耐盐性综合评价

由图2 可知，盐胁迫下不同小麦品种（系）相对胚芽鞘长、相对发芽率、相对鲜质量的隶属函数值主要集中在0.30～1.00，分别占总数的81.50%、89.02%、92.49%；相对根长、相对苗高的隶属函数值主要集中在0～0.49，分别占总数的80.92%、89.60%。98 个（占总数的56.65%）小麦品种（系）的耐盐性综合隶属函数值在0.30～0.49；57 个（32.95%）小麦品种（系）的耐盐性综合隶属函数值在0.50～0.59；分别只有8（4.62%）、10 个（5.78%）小麦品种（系）的耐盐性综合隶属函数值在0.20～0.29 和0.60～0.79。

2.3 小麦抗旱性、耐盐性各指标间的相关性分析

由表1 可知，干旱胁迫下相对胚芽鞘长、相对根长、相对苗高、相对发芽率、相对鲜质量隶属函数值两两间相关系数绝对值在0.04～0.36；各指标隶属函数值与抗旱综合隶属函数值间的相关系数在0.49～0.70，且均达极显著水平。盐胁迫下相对胚芽鞘长、相对根长、相对苗高、相对发芽率、相对鲜质量隶属函数值两两间相关系数绝对值在0.06～0.21；各指标隶属函数值与耐盐综合隶属函数值间的相关系数在0.46～0.56，且均达极显著水平。相对鲜质量、相对胚芽鞘长、相对苗高在旱盐2 种胁迫下隶属函数值相关系数分别达到0.50、0.52、0.63，且均为极显著水平；抗旱、耐盐综合隶属函数值间的相关系数为0.43，且达极显著水平。

表1 小麦抗旱性、耐盐性各指标间的相关性分析

2.4 小麦干旱、盐胁迫响应差异表达基因及功能注释的比较分析

从图3 可以看出，与非胁迫处理相比，胁迫处理下共鉴定到3 311 个上调和4 712 个下调表达基因（变化倍数≥2，FDR 值＜0.01）。其中，干旱胁迫特异上调基因数为1 717 个，盐胁迫特异上调基因数为650 个，旱盐共上调基因数为944 个；干旱胁迫特异下调基因数为2 901 个，盐胁迫特异下调基因数为209 个，旱盐共下调基因数为1 602 个。随后，对差异表达基因进行GO 功能富集分析，显著富集的前20 个亚类结果显示，旱盐上调基因富集亚类相同的有18 个（图4-A、B），旱盐下调基因富集亚类相同的有19 个（图4-C、D），均包括分子功能（molecular_function）、生物学过程（biological_process）、代谢过程（metabolic process）、催化活性（catalytic activity）等功能亚类。

3 结论与讨论

3.1 采用隶属函数法综合评价小麦的抗旱性和耐盐性

隶属函数法属于模糊评价函数的概念[25]，可基于多个指标对小麦抗旱、耐盐性进行全面而客观的评价[31，33-34]。本研究将每个小麦品种（系）各指标抗旱或耐盐指标的隶属函数值相加并取平均值，避免了使用单一指标进行评价的不准确性，评价结果更加科学、可靠。

3.2 基于形态指标的抗性鉴定结果小麦抗旱性和耐盐性的相关性

张会丽[35]应用主成分分析和隶属函数法对36 个玉米品种（系）的生理和农艺性状指标进行综合评价发现，部分耐盐碱性强的品种（系）其抗旱性也较强，但部分抗旱性强的品种（系）则对盐碱胁迫较为敏感，总体而言，抗旱性和耐盐碱性存在一定的相关性。本研究基于173 个小麦品种（系）形态指标的抗旱、耐盐性数据，采用隶属函数法综合评价小麦的抗旱耐盐性后进行相关性分析。鉴于统计学上认为，相关系数r 的取值范围是-1≤r≤1。当0＜r≤1时，成正相关关系；当r=0 时，不相关；当-1≤r＜0时，成负相关关系。r 的绝对值越大，相关程度越高。一般认为，0.8≤|r|＜1，存在极强相关性；0.6≤|r|＜0.8，强相关；0.4≤|r|＜0.6，中度相关；0.2≤|r|＜0.4，弱相关；0＜|r|≤0.2，极弱相关性，或认为不相关。本研究结果认为，旱/盐胁迫下各形态指标间均为弱/极弱相关性，但是其与综合抗旱/耐盐性间的相关性达到中度及以上（相关系数为0.46～0.70）；相对胚芽鞘长、相对鲜质量两指标在旱盐2 种胁迫间为中度正相关性（相关系数分别为0.52 和0.50），相对苗高在旱盐2 种胁迫间为强正相关性（相关系数达0.63）。鉴于综合隶属函数最能客观评价品种（系）的抗旱耐盐性，本研究发现，抗旱、耐盐综合隶属函数值间的相关系数为0.43，因此，本研究认为小麦的抗旱耐盐性间为中度正相关关系。因此，可以对筛选出的抗旱性（耐盐性）突出的小麦品种（系）进行耐盐性（抗旱性）鉴定，有望筛选到同时适用于旱地、盐碱地的既抗旱又耐盐的小麦品种（系）。

3.3 基于转录测序结果小麦抗旱性和耐盐性的相关性

干旱、盐胁迫48 h 小麦叶片高通量转录组测序结果显示，干旱、盐胁迫共上调基因数（944 个）分别占旱（2 661 个）、盐（1 594 个）胁迫上调基因总数的35.48%和59.22%，干旱、盐胁迫共下调基因数（1 602 个）分别占干旱（4 503 个）、盐（1 811 个）胁迫下调基因总数的35.58%和88.46%。说明小麦中很多基因是旱、盐胁迫双重响应的，在小麦抗旱、耐盐性中均发挥作用。如Tamyb59 在PEG 和盐处理下均呈现先上升后下降的表达趋势，该基因的过表达能够同时提高转基因小麦的抗旱性和耐盐性[36]；TaHsfA6f 受高温、脱水、盐分、低温和多种激素的诱导表达，且拟南芥超表达株系较野生型株系表现出更强的抗旱性与耐盐性[37]。上述这些说明小麦抗旱、耐盐性的内在遗传机制有一定共性。差异表达基因的GO 功能富集结果显示，干旱、盐胁迫上调基因显著富集前20 个亚类相同的有18 个，干旱、盐胁迫下调基因显著富集前20 个亚类相同的有19 个。进一步说明小麦在应对干旱、盐胁迫逆境中，很大程度上采用了相似的调控机制。藏金萍[38]利用IR64/Binam 和特青/Binam 2 个导入系群体对水稻抗旱性、耐盐性进行分析，分别鉴定到5、3 个抗旱性QTL 与耐盐性QTL 相互重叠的基因组区域。鉴于不同作物间生长发育及应对胁迫的相似性，结合本研究结果，初步认为小麦抗旱性、耐盐性之间确实存在一定相关性，对抗旱、耐盐共响应基因进行有效的遗传操纵，或者对抗旱性、耐盐性QTL 重叠区进行有效的选择，有可能培育出既抗旱又耐盐的小麦新品种。

3.4 展望

鉴于芽苗期是小麦旱、盐胁迫最为敏感的时期，以及工作量等现实问题，本研究主要基于173 个小麦品种（系）芽苗期形态指标数据进行了小麦抗旱性、耐盐性间的相关性分析，为了使研究结果更加科学合理可信，应该结合生理生化指标、成株期鉴定指标及产量数据进行综合分析，但是本研究结果对小麦抗旱耐盐性研究仍有一定的指导意义。