小鼠品系、性别及体重对猪丹毒活疫苗(G4T10株)安全性评价的影响

任小侠，赵俊杰，彭国瑞，程君生，吴思捷，姚文生，王团结

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

20世纪80年代初，猪丹毒、猪肺疫和猪瘟是困扰我国养猪业的三大传染病，给养猪业造成了严重的经济损失。随着猪丹毒疫苗的广泛使用，本病得到有效控制。近年来，猪丹毒作为人畜共患病呈现零星散发态势，应当引起高度关注[1]。

目前，在我国经批准上市的猪丹毒疫苗有灭活疫苗和活疫苗。与灭活苗相比，猪丹毒活疫苗免疫原性更好，能引发机体更强的免疫保护。我国兽用生物制品签发批次数据显示， 2019年猪丹毒活疫苗签发批次约占88.1%。在猪丹毒活疫苗生产和检验中普遍存在一个共性问题：G4T10株活疫苗单苗或三联苗在选择小鼠进行安全性检验时，常发生因选择不同品系小鼠出现安全性检验结果不同的情况，导致无法确定产品质量是否合格。若选择用猪进行检验，相比使用小鼠检验，成本大幅增加，浪费不必要的人力物力。研究表明，小鼠的免疫反应受遗传因素控制或影响，如小鼠品系、性别或发育阶段等因素。本研究以困扰猪丹毒活疫苗(G4T10株)安全性检验问题为导向，系统探讨了小鼠品系、性别等因素对其安全性检验结果的影响，旨在发掘适用于当前猪丹毒活疫苗(G4T10株)安全性检验小鼠的关键信息，为相关质量标准修订和生产检验提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 马丁肉汤、马丁琼脂，购自北京中海生物科技有限公司；猪丹毒活疫苗(G4T10株)(产品批号：1901003)，购自中牧实业股份有限公司江西生物制品厂；200 mg/mL铝胶生理盐水，购自广西丽原生物股份有限公司。

1.1.2 实验动物 不同品系(C57BL/6N、ICR、KM、Balb/c)、性别及体重SPF级小鼠，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.3 仪器设备 生物安全柜(型号NU-425-600B),NUAIRE公司产品；隔水式恒温培养箱(型号GNP-9270)，上海精宏实验设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 活菌计数 随机抽取3瓶该批疫苗，每瓶疫苗样品用10.0 mL马丁肉汤在生物安全柜内进行复溶，用马丁肉汤作为稀释液进行10倍系列稀释。先取一系列试管，每一管加入9.0 mL稀释液，然后准确吸取菌液1.0 mL，放入盛有稀释液的第1支试管，混合均匀后，另取1支试管吸取1.0 mL放入第2管，依次稀释至最后1管。吸取最终稀释度的菌液接种适宜的含100 mL/L血清的马丁琼脂培养基平板3个，每个平板滴入0.1 mL菌液，使菌液均匀散开，37 ℃正置晾干后，翻转平板，在恒温培养箱内倒置培养48 h。

菌落计算：肉眼观察平板中的菌落，并在平板底面计数，算出3个平板的平均菌落数，计算出每头份疫苗中含有的活菌数(CFU)。最终稀释度选择每个平板菌落数为40～200的稀释度。

1.2.2 安全性检验标准方法 按照疫苗标签注明头份，将疫苗用200 mg/mL氢氧化铝胶生理盐水稀释，皮下注射体重20 g～22 g小鼠10只，每只注射2头份，观察14 d。注射G4T10疫苗的小鼠至少8只健活。否则，可用小鼠按照上述方法重检1次，如果仍不符合规定，可用猪检验1次[2]。

1.2.3 分组 不同品系小鼠对G4T10疫苗安全性检验的影响： 4种品系小鼠分别为KM、Balb/c、C57BL/6N和ICR，分别按照上述检验方法各注射2头份、6头份和10头份， 每组10只小鼠，重复3次试验。同时，小鼠体重均位于20 g～22 g之间，全部为雌性。

不同性别小鼠对G4T10疫苗安全性检验的影响：采用雌性和雄性ICR小鼠(体重20 g～22 g)，分别按照上述检验方法各注射2头份、6头份和10头份， 每组10只小鼠，重复3次试验。

不同体重小鼠对G4T10疫苗安全性检验的影响：采用13 g、21 g和29 g雌性ICR和C57BL/6N小鼠，分别按照上述检验方法各注射2头份、6头份和10头份， 每组10只小鼠，重复3次试验。

1.2.4 数据统计 按照1.2.2所述，单次试验小鼠死亡数量不超过2只判定为合格,安全性检验合格率=试验合格批次/3。小鼠死亡率=3次试验小鼠死亡总数/30。

2 结果

2.1 猪丹毒活疫苗(G4T10株)活菌计数

猪丹毒活疫苗(G4T10株)的活菌计数结果分别为10.4×108CFU/头份、12.7×108CFU/头份、7.8×108CFU/头份，以每批产品3瓶样品中含活菌数的最小值为最终结果，符合《中华人民共和国兽药典》(2015年版三部)中猪丹毒活疫苗活菌计数中每头份疫苗中含G4T10活菌应不低于5.0×108CFU的要求。

2.2 不同品系小鼠对猪丹毒活疫苗(G4T10株)安全性评价的影响

接种6头份和10头份猪丹毒活疫苗(G4T10株)后，4种品系小鼠全部死亡；在2头份剂量组，只有C57BL/6N品系小鼠能够通过安全性检验，合格率为100%。另外，随着接种剂量增加，C57BL/6N小鼠死亡率从13.3%上升至93.3%(表1)。

表1 不同品系小鼠对猪丹毒活疫苗(G4T10株)安全性评价的影响

2.3 不同性别小鼠对猪丹毒活疫苗(G4T10株)安全性评价的影响

雌性或雄性的ICR小鼠在分别接种3种不同剂量的猪丹毒活疫苗(G4T10株)后死亡率达到96.7%～100%，安全性检验合格率为0(表2)。

表2 不同性别ICR小鼠对猪丹毒活疫苗(G4T10株)安全性评价的影响

2.4 不同体重小鼠对猪丹毒活疫苗(G4T10株)安全性评价的影响

13 g～14 g、21 g～22 g和29 g～30 g共3个体重规格ICR小鼠安全性检验合格率均为0。在29 g～30 g组ICR小组死亡率在83.3%～96.7%，其他各组死亡率为100%(表3)。

表3 不同体重ICR小鼠对猪丹毒活疫苗(G4T10株)安全性评价的影响

同时，用3种体重规格的C57BL/6N小鼠进行安全性评价，结果表明，在13 g～14 g、17 g～18 g及21 g～22 g三组小鼠免疫2头份猪丹毒活疫苗(G4T10株)安全性检验合格率为100%，死亡率在6.7%～10%(表4)。

表4 不同体重C57BL/6N小鼠对猪丹毒活疫苗(G4T10株)安全性评价的影响

3 讨论

猪丹毒活疫苗制造及检验规程由哈尔滨兽医研究所和江苏农业科学院提出，已经多次修订，用于规范和指导猪丹毒活疫苗的生产和检验[3]。我国兽药典(2015年版三部)也收录了猪丹毒活疫苗质量标准。按照质量标准规定，G4T10株活疫苗安全性检验10只小鼠至少8只健活。本研究比较了不同品系小鼠对合格猪丹毒活疫苗(G4T10株)安全性检验结果的影响，ICR、KM小鼠死亡率均超过80%，不符合质量标准要求。造成该标准不适用的主要原因可能在于生产用G4T10毒株毒力返强或变异。朱良全等[4]的研究结果表明， G4T10株菌落形态受培养基的质量影响，菌落形态则影响小鼠的安全性试验结果。国外则按照不同细菌代谢特点设计合成培养基，成分相对稳定，可在发酵过程中在线检测、监控和及时调整[5-6]。目前，我国兽药典对培养基的质量控制已有相应的标准，但是还有部分指标亟需完善。另外，生产企业对生产用毒株应严格控制使用代次，确保生产用菌毒品种符合安全性要求。

在兽用生物制品检验过程中，使用本动物或者易感动物进行动物试验是验证兽用生物制品质量是否合格的重要检验环节之一。目前研究普遍认为，实验动物对微生物的易感性或免疫反应受其遗传因素的控制，说明不同品系或者规格的实验动物对不同微生物的易感性表现不同。为了解决猪丹毒活疫苗(G4T10株)小鼠安全性检验问题，本研究系统比较了实验小鼠的品系、性别和体重等因素对G4T10株活疫苗安全性检验结果的影响。结果证实，按照我国兽药典猪丹毒活疫苗(G4T10株)质量标准要求进行其安全性检验，C57BL/6N小鼠在注射2头份剂量14 d后的健活数量符合检验要求，可以通过安全性检验，而Balb/c、ICR、KM 3种品系小鼠死亡率超过80%，不符合检验要求。因此可见，不同品系小鼠对猪丹毒活疫苗(G4T10株)的易感性存在明显差异，对检验结果有重要影响。近年来，Balb/c-C57BL/6小鼠模型已被广泛用于细菌感染的免疫病理研究，如Balb/c和C57BL/6小鼠对鼠痘病毒和类鼻疽伯克氏菌的免疫反应不同[7-8]。在本研究中，C57BL/6N与其他品系小鼠对猪丹毒活疫苗(G4T10株)免疫反应差异的分子机制尚需进一步研究。同时，本研究还探索了小鼠性别和体重因素对猪丹毒活疫苗(G4T10株)安全性检验的影响。ICR雌鼠和雄鼠并没有在2头份剂量猪丹毒活疫苗(G4T10株)免疫后表现出差异，可能是因为毒株毒力较强或者性别因素差异不大，还需进一步证实；而在体重因素的研究中则证实，13 g以上C57BL/6N小鼠均可通过猪丹毒活疫苗(G4T10株)安全性检验，而ICR小鼠虽然随着体重增加，其死亡率有所下降，但是仍然不符合质量标准要求。

因此，从本研究结果来看，建议从以下两个方面加快推进相关工作。一是全面评估猪丹毒活疫苗(G4T10株)质量标准的适用性，对产品活菌数应规定检验上限，对安全性检验用小鼠的品系等进行明确要求；二是进一步完善猪丹毒菌株生产检验用培养基质量标准。