白术多糖对小鼠胸腺与脾脏指数、组织结构及p38/MAPK信号通路的影响

陈非玥,洪龙胜,李婉雁,梁舒棋,肖咏儀,田允波,许丹宁,曹 楠*

(1.仲恺农业工程学院，广东广州 510225； 2.广东省水禽健康养殖重点实验室，广东广州 510225)

免疫器官是机体执行免疫功能的主要场所及防御侵害的天然屏障。毒物、细菌、病毒等可使机体免疫细胞增殖受抑制，免疫器官发育受损，从而影响机体免疫应答能力。在小鼠淋巴结肿大、中性粒细胞增生、脾内巨噬细胞增生和浸润等病理过程中，致病因子常通过作用于MAPKs信号通路来介导相关的炎症反应[1-2]。据报道，p38/MAPK受药物抑制后，可使动物胸腺中早期T细胞发育阻滞、胸腺细胞数量减少，造成胸腺免疫功能障碍[3-5]，并使脾细胞凋亡损伤，对机体产生不良影响[6]。

近年来，中草药多糖因其低毒性、多靶点、不易产生耐药性等优点得以广泛应用。值得注意的是，多糖通常存在一个发挥其功效的最适浓度范围，浓度过高可能会抑制部分免疫细胞的免疫活性。白术多糖(polysaccharide ofAtractylodesmacrocephalaKoidz，PAMK)是白术发挥其生物功效的主要成分。已有研究表明，白术多糖及其他补益类中药多糖可提升机体免疫器官指数，促进淋巴细胞的增殖与分化，增强巨噬细胞、NK细胞等免疫细胞的活性，促进细胞因子生成与分泌，参与抗体和补体的形成，并可激活MAPK/AP-1信号通路诱导DC细胞成熟[7-9]。因此，研究不同浓度的白术多糖对动物机体免疫功能的调节作用具有一定理论意义，可为相关的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 白术多糖 白术多糖(PAMK)，多糖含量为95%，西安市天园生物制剂厂产品。

1.1.2 实验动物 40只4周龄雌性Balb/c小鼠，购于南方医科大学。

1.1.3 主要试剂 40 mg/mL多聚甲醛通用型组织固定液(BL539A)，广州赛国生物科技有限公司产品；高效切片石蜡，上海华申康复器材有限公司产品；TRIzol RNA分离试剂(15596026)，美国Ambion公司产品；2×PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(A25742)，美国Applied Biosystems公司产品；反转录试剂盒(Rr036A)，TaKaRa公司产品。

1.1.4 主要仪器 电子天平(FA1604)，上海精密科学仪器有限公司产品；石蜡包埋机(EC300)、石蜡切片机(HM340E)，德国MICROM公司产品；双目显微镜(ECLIPSE E100)，日本Nikon公司产品；超微量紫外分光光度计(Epoch)，美国Bio-Tek公司产品；实时荧光PCR仪(PRISM 7500)，美国Applied Biosystems公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 将试验小鼠随机分为5组，分别为对照组与4个不同浓度的白术多糖处理组。其中，处理组给药剂量为每日100、200、400、600 mg/kg，对照组给予等剂量的生理盐水，连续灌胃14 d。饲养环境均处于同一水平：温度18 ℃～29 ℃，相对湿度40%～70%，氨浓度≤15 mg/m3，每天定时称重给药、更换垫料，并提供充足的饲粮和饮用水。

1.2.2 胸腺与脾脏指数测定 饲养至第15天时对小鼠进行活体称重，随后处以安乐死，在无菌环境下采集胸腺与脾脏，分别称重，按照以下公式计算胸腺指数与脾脏指数。

胸腺指数=胸腺重量(mg)/体重(g)；

脾脏指数=脾脏重量(mg)/体重(g)。

1.2.3 胸腺与脾脏组织显微结构观察 切取0.5 cm3的组织块，于40 mg/mL多聚甲醛溶液中固定，制备石蜡切片，具体参照何书海等[10]的方法进行。通过正置显微镜观察胸腺与脾脏组织结构，并利用CCD采集图像。

1.2.4 real-time PCR检测基因表达量 使用TRIzol提取胸腺与脾脏组织总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量、超微量紫外分光光度计测定RNA浓度，再根据浓度用反转录试剂盒进行逆转录获得cDNA，将cDNA保存于-20 ℃冰箱备用。

根据NCBI数据库序列，设计合成相关引物。引物名称与序列信息见表1。采用SYBR Green荧光染料法进行目的基因表达检测，总反应体系20 μL，包括 cDNA 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 10 μL，dH2O 7 μL。反应条件为:50 ℃ 2 min;95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 25 s，共40个循环。采用2-△△Ct算法计算小鼠胸腺组织与脾脏组织中p38/MAPK信号通路相关的关键基因ASK1、p38、MSK1/2 mRNA的相对表达量，以GAPDH作为内参基因。

表1 引物序列信息

1.2.5 数据统计与分析 试验数据使用Prism 7.0软件进行单因素方差分析，Tukey多重比较法进行组间比较，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 各组小鼠体重、胸腺与脾脏重、胸腺与脾脏指数的比较

结果见表2。由表2可知，相比于对照组，添加100、200、400 mg/kg白术多糖均可上调胸腺指数，而添加200、400、600 mg/kg白术多糖则可上调脾脏指数，且浓度为200 mg/kg时，胸腺与脾脏的重量及器官指数皆显著升高(P<0.05)，说明添加200 mg/kg白术多糖可更好的促进免疫器官发育，并更有利于机体的新陈代谢。

表2 各组小鼠体重、胸腺与脾脏重、胸腺与脾脏指数的比较

2.2 不同浓度白术多糖对小鼠胸腺组织结构的影响

结果见图1。由图1可知，对照组胸腺皮质厚度与髓质面积适中，皮质内淋巴细胞排列整齐，髓质内散布着胸腺上皮细胞，细胞形态良好，被膜结构完整。与对照组相比，100 mg/kg组胸腺组织结构无明显变化；200 mg/kg组胸腺组织中皮质相对较厚、染色较深，其中富含胸腺细胞，整体而言细胞分布排列规则整齐；而400 mg/kg组和600 mg/kg组的胸腺组织均呈现出皮质略薄、染色较浅的状态，且400倍镜下可见600 mg/kg组的细胞排列稍为疏松。

2.3 不同浓度白术多糖对小鼠脾脏组织结构的影响

结果见图2。由图2可知，对照组脾脏组织结构正常，白髓与红髓交叉分布，动脉周围淋巴鞘轮廓较为明显，大小适中，淋巴细胞排列规整。而相比于对照组，100 mg/kg组的白髓结构正常，动脉周围淋巴鞘稍有增大，但整体结构无明显变化；200 mg/kg组的脾脏组织中，动脉周围淋巴鞘面积增大，淋巴细胞密集且排列规则整齐；400 mg/kg组的脾脏组织中，红髓与白髓的结构及界限清晰，但白髓面积及动脉周围淋巴鞘大小无明显变化；600 mg/kg组的脾脏组织中，动脉周围淋巴鞘面积有所增大，但细胞排列较为疏松。

A～E.对照组、白术多糖100、200、400、600 mg/kg组(100×)；a～e.对照组、白术多糖100、200、400、600 mg/kg组(400×);▲.髓质；★.皮质

A～E.对照组、白术多糖100、200、400、600 mg/kg组(100×)；a～e.对照组、白术多糖100、200、400、600 mg/kg组(400×)；→.动脉周围淋巴鞘

2.4 不同浓度白术多糖对小鼠胸腺组织p38/MAPK信号通路相关关键基因mRNA相对表达量影响

结果如图3所示。200 mg/kg组胸腺组织与脾脏组织内关键基因mRNA相对表达量的上调趋势最为明显。在胸腺组织样品组，200 mg/kg组ASK1、MSK2 mRNA的相对表达量显著高于其他组别(P<0.05)，p38 mRNA的相对表达量显著高于对照组与600 mg/kg组(P<0.05)。此外，600 mg/kg组ASK1、p38、MSK1/2 mRNA的相对表达量均低于对照组，但差异不显著(P>0.05)，表明600 mg/kg对p38/MAPK信号通路可能存在负性调节作用。

2.5 不同浓度白术多糖对小鼠脾脏组织p38/MAPK信号通路相关关键基因mRNA相对表达量影响

结果如图4所示。相比于对照组，400 mg/kg组ASK1、MSK2 mRNA的相对表达量显著上调(P<0.05)，200 mg/kg组p38、MSK1/2 mRNA的上调趋势则更为显著(P<0.05)，说明400 mg/kg对p38/MAPK信号通路有一定程度的正向调节作用，但作用效果远不及200 mg/kg组明显。

3 讨论

胸腺是T细胞发育、分化、成熟的场所。研究表明，小鼠通常在18日龄后胸腺重量就开始下降，主要表现为皮质变薄，皮质与髓质面积比下降、分界逐渐模糊，胸腺小体数量减少等[11-12]。脾脏是免疫细胞定居的场所，同时作为血液循环中重要的过滤器官，可清除血液内的病原体、衰亡的血细胞与免疫复合物等[13-14]。胸腺和脾脏分别代表动物的中枢免疫器官和外周免疫器官，其组织形态结构的完整性与否代表着动物免疫机能是否健全。相关病理组织学研究显示，芦荟多糖可使衰老小鼠的胸腺富含淋巴细胞，皮质增厚，皮质与髓质间界限明晰，细胞形态规整，表明芦荟多糖可降低小鼠胸腺淋巴细胞的衰老性减少，发挥抗衰功效[15]；黄芪多糖可升高小鼠的脾脏重量与脾脏指数，并使睡眠被剥夺小鼠的动脉周围淋巴鞘厚度升高至正常水平，表明黄芪多糖可有效改善小鼠的脾组织结构[16]；天门冬多糖可缓解由环磷酰胺诱导的小鼠免疫器官组织结构损伤，使其胸腺内皮质区增大、髓质区减小，并显著提升脾脏指数[17]；丹参多糖则可上调免疫功能低下小鼠的胸腺指数与脾脏指数，并可使糖尿病小鼠脾脏动脉周围淋巴鞘变厚，淋巴细胞排列更为紧密[18-19]。上述研究充分反映了多糖作为免疫增强剂对组织器官的保护效果。在本研究中，添加了200 mg/kg白术多糖后，小鼠胸腺重量与胸腺指数比对照组显著升高，胸腺皮质相对较厚，淋巴细胞数量较多，皮质与髓质间的界限清晰，表明白术多糖在适宜浓度下可促进免疫细胞的增殖，从而促进胸腺的发育。灌服白术多糖后，小鼠脾脏重量与脾脏指数同样显著上调，脾脏组织内动脉周围淋巴鞘相对增厚，淋巴细胞密集分布，脾脏结构更为完善。此外，100 mg/kg组相比于对照组无明显变化；而600 mg/kg组的作用效果不佳，其中淋巴细胞相对较少，细胞排列较为疏松，可能是因白术多糖的浓度过高会对组织产生一定的不良影响。这与李鹏等[20]研究获得的白术多糖浓度在250 mg/kg～500 mg/kg时可增强小鼠脾脏内单核巨噬细胞的免疫活性的结果相似。Ren Z等[21]的研究结果表明，200 mg/kg和400 mg/kg剂量的大叶贯众多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠有较好的免疫调节作用，而100 mg/kg的剂量效果不明显；王向涛等[22]研究则反映，中高剂量的龙葵多糖可明显提升S180荷瘤小鼠的胸腺与脾脏指数，但高剂量组荷瘤小鼠的生存时间及抑瘤率不如中低剂量组，其中中剂量组的抑瘤效果最佳。由此可见，多糖在合适的剂量下可更为有效的增强机体的免疫应答能力，抵御机体内外环境中的不良影响。本研究结果表明，白术多糖浓度为200 mg/kg时可更好的发挥其免疫调节作用，提升小鼠的胸腺与脾脏指数，促进胸腺与脾脏结构和功能的完善。

同一基因内上标小写字母不同表示组间差异显著(P<0.05)，小写字母相同表示组间差异不显著(P>0.05)

同一基因内上标小写字母不同表示组间差异显著(P<0.05)，小写字母相同表示组间差异不显著(P>0.05)

p38是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成员之一，在细胞的生长、发育、分化、凋亡和细胞间功能同步等多种过程中发挥重要作用[23]。ASK1为p38/MAPK信号通路最上游与调控细胞凋亡相关的MAPKKK类激酶，可平衡和整合细胞的应激反应并作出合适应答。ASK1受相应刺激致磷酸化后可促进MKK3/6基因表达，并促其表达的蛋白磷酸化从而诱导p38 MAPK基因转录，活化的p38 MAPK可将MSK1/2磷酸化，进一步调节细胞反应[24]。有研究者将小鼠脾脏巨噬细胞用p38/MAPK抑制剂处理后再予以轻度刺激，处理过的巨噬细胞与未经处理的相比较，其吞噬、趋向及杀伤能力大幅减弱，表明脾脏的免疫调节能力因p38/MAPK信号通路未能激活而有所下降[25]。还有研究证明，TNF-α与IL-1可激活p38/MAPK并激活胸腺细胞内AP-1、NF-AT及NF-κB的转录，故p38/MAPK可调控胸腺细胞的成熟和分化[26]。此外，Li Q等[27]发现富硒食用茹多糖可能通过作用于多条MAPK信号通路提升小鼠血清中丙二醛含量及抗氧化酶类的活性。刘晶等[28]也研究发现，米糠多糖可通过MAPK信号通路缓解由葡聚糖硫酸钠引起的小鼠结肠炎，并抑制脾脏水肿和炎症反应。可见，MAPK信号通路在多糖免疫调节机制中发挥了关键作用。本研究中，200 mg/kg组小鼠的胸腺与脾脏组织中p38/MAPK信号通路相关的关键基因表达量均有一定程度的升高，并且该浓度白术多糖对p38/MAPK级联反应途径中处于下端的激酶MSK1/2有较为明显的正向促进作用；而白术多糖浓度为100 mg/kg时，可能因剂量过低而作用效果不明显；浓度为600 mg/kg时，则可能因浓度过高对机体产生负性调节作用。本研究结果也表明，当浓度白术多糖为200 mg/kg时可更好的激活p38/MAPK信号通路，进一步调节细胞反应。结合小鼠的胸腺和脾脏指数变化以及组织切片观察结果，进一步说明灌服200 mg/kg白术多糖，可促进小鼠免疫器官中免疫细胞的增殖，从而提升机体的免疫机能。

在200 mg/kg浓度下，白术多糖作为外来刺激原能激活小鼠胸腺与脾脏组织细胞的p38/MAPK信号通路，提高相关基因的表达量，促进淋巴细胞的增殖，从而促进免疫器官发育、改善免疫器官的结构与功能，提高机体的免疫应答能力。