栽培丹参居群内转录间隔区(ITS)遗传多样性分析

廖 芳，任瑞花，孙 涛，孔德英，王仲敏，刘静远，印丽萍，李关荣*

(1.天津海关动植物与食品检测中心，天津 300461；2.西南大学农学与生物科技学院，重庆 400716； 3.重庆海关技术中心，重庆 401147； 4.上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135)

【研究意义】丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)属唇形科(Labiatae)鼠尾草属(Salvia)植物，别名红根、赤参，是一种主要以根及根茎入药的多年生草本植物[1]。其药用历史悠久，药理作用广泛，具有祛瘀止痛、活血通经、镇静安神、消肿止痛等功效[2]。目前其栽培品种为丹参药材的主要来源，主产区为山东临沂、河南焦作、山西万荣、陕西商洛、四川中江等地[3]。栽培生产上引种的随意性、种植管理不规范性，产生了种源混乱、品种混杂、质量不稳等问题[4]，因此，寻找快速准确鉴别不同丹参栽培居群的分子标记具有重要的意义。【前人研究进展】前人曾基于生物学性状[5]、显微结构[6]对丹参的种质资源进行过鉴别，但丹参的形态学表现随不同的环境条件差异极大，给其鉴定的准确性带来问题。近些年来，在DNA分子水平上揭示多态性的分子标记技术成为了研究植物遗传多样性的有力工具，可以区分不同来源的不同形态个体，被广泛用于药用植物的居群鉴别及种间鉴别[7]。如唐晓清等[8]发现AFLP技术可作为鉴别丹参种内不同类型间遗传差异的手段,丹参种内存在较为丰富的遗传变异。【本研究切入点】核糖体DNA内转录间隔区(Internal transcribedspacer,ITS)序列是核糖体DNA中位于18S、5.8S、28S之间的序列，分别由ITS1和ITS2组成，其中内转录间隔区1(ITS1)位于18S rDNA和5.8S rDNA之间，内转录间隔区2(ITS2)位于5.8S rDNA和28S rDNA之间[9]。在核糖体基因组中，ITS区序列进化速度快，可提供较丰富的变异位点及信息位点[10]。刘灵娣等[11]研究了28份不同来源丹参种质的rDNAITS序列，其完全序列在600～619 bp，ITS1为227～228，5.8S 为166 bp，ITS2为206～224，发现其变异主要发生ITS1和ITS2区，变异位点数分别为31和25，变异率分别为13.5%和11.2%;汪红等[12]也对13个鼠尾草属植物的ITS序列进行了分析，发现其ITS1、ITS2长度分别为222～224和220～223 bp，ITS1的差异百分率在0～12.16%，ITS2的差异百分率在0.5%～13.5%，而丹参种内差异百分率ITS1为 0～0.9%，ITS2为 0～0.5%。【拟解决的关键问题】本文对国内33个地区征集的42个丹参栽培居群的ITS序列进行了PCR扩增、测序和序列分析，以了解其遗传多样性、系统发育关系，为丹参栽培居群种质资源的遗传鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

来自国内33个地区的42种丹参栽培居群见表1，经本实验室形态鉴定确认均为丹参。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取 采用CTAB法提取基因组DNA[13]。称取100 mg幼叶，经液氮磨成粉末后加入预热的CTAB提取液700 μL(用前加终浓度为2%的β-巯基乙醇)中；65 ℃水浴中45 min，期间不断颠倒混匀；取出后趁热加入等体积700 μL的氯仿-异戊醇(24∶1 V/V)，颠倒混匀后充分乳化约10 min，12 000 r/min离心10 min；取上清液，加入2 μL RNase，室温放置30 min；加入等体积的氯仿-异戊醇，混匀乳化10 min，12 000 r/min离心10 min；取上清液，加入等体积的冷异丙醇，颠倒混匀，12 000 r/min离心10 min；弃上清液，依次用700 μL 75%乙醇洗涤沉淀两次，最后吸干75%的乙醇，再用无水乙醇漂洗产物1次；沉淀于室温下干燥片刻，当看不到乙醇液渍且沉淀块开始出现半透明时为止；加50 μL双蒸水溶解沉淀；置于-20 ℃冰箱中保存。

表1 本研究采用的丹参材料

1.2.2 PCR扩增与测序 采用ITS通用引物：上游引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、下游引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行ITS扩增。PCR扩增体系：1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，ITS1(10 μmol/L)1 μL，ITS4(10 μmol/L)1 μL，DNA模板1 μL。PCR扩增程序：98 ℃预变性3 min，98 ℃10 s，55 ℃10 s，72 ℃15 s，35个循环，72 ℃延伸1 min。

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，GoldView染色，用FR-980A凝胶成像仪观察记录。扩增产物经回收、纯化，由重庆市擎科兴业生物技术有限公司进行双向测序。

1.2.3 数据分析 用BioEdit 7.09软件对42个丹参居群的ITS序列进行分析；使用软件MEGA X中的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)与自展检验(Bootstrap=1000)构建系统发生树。

2 结果与分析

2.1 丹参居群基因组DNA的提取检测

CTAB法提取的不同丹参居群的基因组DNA质量较好，电泳条带较清晰(图1)。

2.2 丹参ITS的PCR扩增产物

42个丹参居群的PCR扩增产物的电泳显示：各丹参居群的ITS产物条带清晰，大小在500～750 bp 之间，差异不大(图2)。

2.3 丹参ITS序列分析

2.3.1 丹参ITS的总体特征 分析表明，丹参ITS扩增产物包括ITS1、5.8S和ITS2全长及18S、28S的部分序列。总长度为642～684 bp，42个序列全部提交到GenBank获得登录号(表2)；42个不同丹参居群的ITS1、5.8S rDNA和ITS2及全序列，长度在592～621 bp，其ITS1、5.8S rDNA和ITS2分别为203～229、164和226～229 bp；ITS1和ITS2区序列GC含量分别为65.50%～68.84%、62.38%～65.94%，显著高于5.8S rDNA(54.88%)；丹参ITS序列大小ITS1变化最大，ITS2次之，而5.8S rDNA比较保守(表2)。

2.3.2 栽培丹参居群ITS的核苷酸变异分析 42个栽培丹参居群的ITS序列比较分析表明，其ITS1区共有19个变异位点，变异率为8.30%，其中颠换3个，转换13个，缺失1个，插入2个；其5.8S区没有序列差异，高度保守；其ITS2区共有37个变异位点，变异率为16.16%，其中颠换10个，转换26个，插入1个，无缺失。ITS2区的序列变异最大，其次是ITS1区(表3)。42个栽培丹参居群中，发现有3个居群的SNP指纹，即W-SCHY-W-1、V-YNLJ-V-1和W-SXYA-V-3；其中W-SCHY-W-1和V-YNLJ-V-1富含SNP变异位点，是本研究中发现的两个新颖独特材料，二者非常相近；居群W-SXYA-V-3有4个SNP变异位点；居群V-HBCD-V-3、W-HBJM-V-1和W-GZ-V-2多1个共同的缺失位点；而其余36个丹参居群的ITS序列高度保守。

图1 不同居群丹参基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳(材料编号见表1)Fig.1 Gel electrophoregram of genomic DNAs of S.miltiorrhiza cultivated populations(Material No.see table 1)

图2 栽培丹参居群ITS扩增产物的电泳图 (材料编号见表1)Fig.2 Electrophoregram of ITS amplification products of S.miltiorrhiza cultivated populations (Material No.see table 1)

表2 栽培丹参居群ITS序列各区基础数据

表3 不同居群丹参ITS序列核苷酸变异位点

2.4 基于丹参ITS序列的系统发育关系

根据各丹参居群ITS序列，以GenBank的丹参ITS序列(DQ132863.1)为外群(W)，分别构建了基于ITS1、ITS2、ITS1+ 5.8S rDNA +ITS2和ITS扩增产物完整序列(18S +ITS1+ 5.8S rDNA +ITS2+部分28S)的系统发育树，以比较考察其系统发育关系。

ITS1的系统树显示：W-LNSY-V-1单独聚在一分支上，与其余的41个丹参居群聚在一起的大群分离;这一大群又分聚为2个不同分支，一支包含S-NM-V-1、V-JSSY-V-1、V-SXYA-V-3、V-GZ-V-2、V-CQ-V-1、S-HBAG-V-1共6个丹参居群；另一分支包含其余的35个丹参居群，这35个丹参居群又聚在两个分支上，一支包含15个丹参居群，另一只包含20个丹参居群，这一分支中居群W-SHCY-W-1、W-YNLJ-V-1和W聚在一起。其余的18个居群聚在另一个分支上(图3-A)。ITS2序列系统树显示：42个丹参居群聚在2大分支上，其中24个丹参居群聚在一个分支上，其余18个丹参居群聚在另一个分支上，同样可见W-SCHY-W-1与W-YNLJ-V-1聚在一起(图3-B)。完整ITS区(ITS1+5.8S rDNA+ITS2)的系统树显示：除V-GZZY-V-1单独聚在一系支上，其余41个丹参居群聚在另一系支上，在后一系支中S-NM-V-1、V-JSSY-V-1、V-SXYA-V-3、V-GZ-V-2、V-CQ-V-1 聚在一支，其余36个居群聚在另一大支条上；在这一大支上，再次可见W-SHCY-W-1,W-YNLJ-V-1与外群(W)聚在一起(图3-C)。ITS扩增完整序列(18S+ITS1+5.8S rDNA+ITS2+部分28S)系统树显示：S-NM-V-1和V-GD-V-1聚在一系支上，其余40个丹参居群聚在另一系支上。这后一系支又分2个分支，其中19个丹参居群一支；另22个丹参居群为另一支，同样可见，W-SHCY-W-1,W-YNLJ-V-1与外群(W)聚在一起(图3-D)。

综合聚类结果显示：虽然依据不同序列的聚类大体结果相似，但有一些差异，但W-SHCY-W-1、W-YNLJ-V-1总是与外群W聚在一起，说明这两种材料的特殊性。另外S-NM-V-1、V-JSSY-V-1、V-SXYA-V-3、V-GZ-V-2、V-CQ-V-1、S-HBAG-V-1等亲缘关系较近。

3 讨 论

白东东等[14]对9种甘草种质进行了ITS序列分析，并构建了系统发育树，发现ITS2序列可有效的区分5种甘草混伪品；成宇等[15]基于ITS序列对19科26属30种林木树种进行鉴定，发现鉴定成功率达到 83%。

本研究发现W-SCHY-W-1居群的ITS存在42个变异位点；居群V-YNLJ-V-1存在41个；居群W-SXYA-V-3有4个SNP变异位点。与其他居群比较，居群V-HBCD-V-3、W-GZ-V-2和W-HBJM-V-1额外多1个共同的缺失位点；其余36个丹参居群的ITS序列没有变异位点。本研究发现栽培丹参的5.8S区非常保守，这与王迎等[16]研究结果相同，他们分析了27个鼠尾草属药用植物的ITS和5.8S rDNA完整序列，发现5.8S rDNA序列相当保守，而ITS区段则在亚属间差异明显。据ITS的SNP指纹能鉴别3个栽培丹参居群，这与刘灵娣[10]等的研究结果不同，其对28个丹参材料的ITS研究结果表明，此技术足以用于阐明丹参种内演化及其地理分布关系。笔者认为，单一一种分子标记，还不足以鉴别所有栽培丹参居群。不同研究的偏差，很可能是因为研究材料的来源、数目、在生产上的广泛无序交流所致，也可能是栽培丹参的ITS变异还不足以区别各居群。栽培丹参居群的准确可靠的分子鉴定还需要从多个基因上寻找复合分子标记。

A:ITS1;B: ITS2;C:ITS1+5.8S rDNA+ITS2;D:ITS1+5.8S rDNA+ITS2+ partial 28S rDNA图3 基于ITS序列各区构建的不同居群丹参的系统树Fig.3 Phylogenetic trees based on different regions of the ITS of S.Miltiorrhiza cultivated populations

根据聚类结果，笔者认为ITS序列揭示的栽培丹参之间的亲缘关系与地理来源关系不大，这一研究结论与与刘灵娣[11]的研究结果不同。丹参具有较高遗传多样性，但遗传多样性多表现在居群内，不同来源丹参之间的亲缘关系尚不十分明确，丹参居群间的亲缘关系与其地理分布之间关系，不同学者结论不同，这可能与研究者所用的研究材料不同有一定关系，此外，栽培丹参由于存在引种选育等人为因素的影响，与地理分布的关系更为复杂。采用多种分子标记复合指纹鉴定，可能是栽培丹参居群的遗传鉴定可靠的技术。

4 结 论

本研究发现，栽培丹参rDNA的ITS1、5.8S rDNA和ITS2区的长度分别为203～229、164和226～229 bp；其ITS1区大小变化较大，而ITS2区核苷酸变异大。其SNP变异位点存在于ITS1和ITS2区，变异位点数分别为19和37个，变异率分别为8.30%和16.16%。丹参的5.8S区非常保守。本研究发现W-SCHY-W-1居群的ITS存在42个变异位点；居群V-YNLJ-V-1存在41个；居群W-SXYA-V-3有4个SNP变异位点。与其他居群比较，居群V-HBCD-V-3、W-GZ-V-2和W-HBJM-V-1额外多1个共同的缺失位点；其余36个丹参居群的ITS序列没有变异位点。故据ITS的SNP指纹能鉴别3个栽培丹参居群。更为准确可靠的栽培丹参居群分子鉴定可能需要多个基因或标记构成的复合分子标记。