国槐无性系对NaCl胁迫的生长生理响应及耐盐性综合评价

付茵茵，闫文潇，王友晓，庞彩红，李双云，周继磊，闵旭峰，刘盛芳，臧真荣，亓玉昆，夏 阳

（1山东省林业科学研究院/山东省林木遗传改良重点实验室，济南 250014；2山东农业大学林学院，山东 泰安 271018；3中山陵园管理局，南京 210014；4山东省林木种苗和花卉站，济南 250014；5枣庄市山亭区自然资源局，山东 枣庄 277100）

0 引言

国内盐碱地总面积达9913万hm2，从沿海到内陆均有分布，约占全国土地面积的10%，分布在23个省、市、自治区[1]，且面积还在不断增加，这既是经济、社会和生态可持续发展的主要障碍因子，也是重要的后备土地资源[2]。土壤盐碱化已经成为备受瞩目的全球性问题[3-5]。改良和利用盐碱土已经成为确保“耕地红线”不被突破，农业可持续发展的重要手段[6]。Ren等[7]通过对水稻开展盐胁迫适应性的基础研究，选育和培育出了许多耐盐碱性强的水稻品种，大大提高了作物在盐碱地上的产量，使通过选育和培育耐盐碱性强的植物品种种植在盐碱地上成为生物改良的主要手段。相关研究表明，植物形成了一系列复杂的生理机制，包括激素调节、渗透调节、活性氧清除、多胺及信号分子调节等来抵抗盐胁迫[5,8]。因此，通过研究盐胁迫下植物的生理指标进行综合定量评价，是耐盐植物新品种选育的重要依据。

国槐(Sophora japonica)属于豆科(Leguminocae)蝶形花亚科(Papilionoideae)肉果属(Styphnolobium)，又名槐树、家槐、黑槐、槐花木、守宫槐、槐花树、豆槐、金药树等[9]，是中国栽培最为普遍的集观赏、药用、材用等多用途为一体的人文乡土树种[10]。目前关于植物盐胁迫的研究常见于水稻、黄蜀葵、甜瓜等农作物和中草药等草本植物[11-13]，木本植物的耐盐性研究主要集中在杨树、柳树和绒毛白蜡[14-16]等树种上，国槐的盐胁迫研究仅见于气孔导度和光合作用的研究[17-18]，对于盐胁迫的研究鲜有报道。筛选作物的耐盐品种且加以利用是盐碱土改良和利用的有效措施[3,19]，分析盐胁迫下植物的生理效应和分子机制是培育耐盐植物的关键[20]。鉴于此，笔者以收集的山东省1000余份种质资源为基础，通过田间耐盐实验，筛选出4份在不同地域盐碱地上生长优良的无性系，以山东省现有良种为对照，以5个无性系盆栽2年生植株为试材，运用主成分分析对其综合评价抗性指标进行，以期了解其在盐胁迫下的抗逆机理，同时为合理选用盐碱地造林材料提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

以山东省林业科学研究院选育的无性系564（A处理）、‘华夏’（B处理）、‘华硕’（D处理）、‘嫣红3号’（E处理）4份无性系为试材，山东省国槐良种‘鲁槐1号’（C处理）为对照进行实验。

供试材料为2年生嫁接苗。2017年3月8日从苗圃挖取幼苗，移栽至装有培养土（按土7份、沙2份，腐熟有机肥1份比例配制）的塑料花盆（外口径38 cm、内口径32 cm、高28 cm、底部直径25 cm）内育苗。盆土17 kg，每个无性系栽30盆，每盆1株。

试验在山东省济南市历城区的山东省林业科学研究院实验苗圃智能温室（温度25～35℃，湿度70%～90%）内进行。

1.2 研究方法

每个无性系各选取24株冠形均匀长势基本一致、茎粗大致相同的苗木进行实验，在嫁接口高为10 cm处平茬，对苗木进行常规养护管理，土壤含水量一般维持在70%～90%。于2017年8月1日进行NaCl浓度0‰、0.2‰、0.4‰、0.6‰处理，各处理按照盆土干重所加NaCl质量分别为0、34、68、102 g。将NaCl溶液浇入盆中，每个处理重复6株。每盆苗木下放置塑料托盘，以防止土壤溶液流失，在每次浇水后把托盘内液体回浇到盆内，以保持盆内土壤的含盐量。整个实验处理过程为45天，并在9月14日8:30采样，用冰袋冷藏带回实验室。

1.3 实验方法

1.3.1 生长指标测定 实验开始前，测定每个处理内参试苗木苗高H0和地径B0，实验结束后再测定苗高H1和地径B1，苗高增长量为H1-H0，地径增长量为B1-B0，测量工具为钢卷尺和游标卡尺。实验结束时，测定参试苗木的生物量。将参试苗木的根系、枝条、叶子用水清洗干净后于105℃烘箱烘干至恒重，使用电子秤称量质量。

1.3.2 生理指标测定 叶绿素含量测定采用乙醇提取法；细胞膜透性测定采用电导仪法测定；丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法测定；脯氨酸(Pro)含量测定采用酸性茚三酮法；SOD活性测定采用NBT还原法；POD活性测定采用愈创木酚法；CAT活性测定采用紫外吸收法[21]。

1.3.2 数据处理 实验数据处理及柱状图的绘制使用Microsoft Excel进行，用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析、多重比较（Duncan’s法）及主成分分析，采用主成分分析法对5个无性系的耐盐碱能力进行综合评价。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫对苗高增长量的影响

由图1可以看出，5个国槐无性系的苗高增长量随着NaCl处理浓度的增加而明显下降。‘华夏’在4‰和6‰NaCl胁迫下高生长量均高于对照，‘华夏’和‘华硕’在4‰NaCl处理下的苗高增长量最大，且与对照及其他无性系差异达到显著水平，在6‰NaCl处理下‘华夏’与其他无性系苗高增长量差异达到显著水平。无性系的苗高增长量较对照水平下降幅度最小的为‘华夏’(49.8%)，下降幅度最大的为无性系564(62.1%)。

图1 NaCl胁迫对苗高增长量的影响

2.2 NaCl胁迫对地径增长量的影响

由图2可以看出，5个无性系的地径增长量随着NaCl处理浓度的增加表现出下降的趋势。‘华夏’在4‰处理和6‰处理下的地径增长量均是最大，且与其他无性系地径增长量差异达到显著水平。在4‰处理下，‘华夏’地径增长量较对照下降幅度最小，为25.78%，其次为‘华硕’(33.36%)和‘嫣红3号’(34.21%)，下降幅度最大的为无性系564(39.46%)。

图2 NaCl胁迫对地径增长量的影响

2.3 NaCl胁迫对生物量的影响

如图3所示，5个国槐无性系的生物量随着NaCl处理浓度的增加而下降。在对照和2‰处理下，生物量最大的为无性系456，最小的为‘嫣红3号’，但各无性系生物量差异不显著，且两种水平下，生物量差异不明显，表明在2‰处理下，国槐无性系受抑制程度非常小，可正常生长。在4‰NaCl处理下，生物量最大的为‘华夏’，与其他无性系差异显著，与对照相比，其下降幅度为18.08%，受抑制程度最小，其次为‘华硕’，与对照相比其下降幅度为23.61%，苗木生长受到抑制；在6‰处理下，生物量最大的为‘华夏’，与其他无性系差异显著，与对照相比，其下降幅度为30.44%，生物量最小的为‘嫣红3号’，与其他无性系差异显著，与对照相比，其下降幅度为38.54%，苗木生长受到明显抑制。

图3 NaCl胁迫对生物量的影响

2.4 NaCl胁迫对叶绿素含量的影响

随着NaCl处理浓度的增加，各无性系的叶绿素含量均呈下降趋势（图4）。与对照相比，在2‰处理下，‘华夏’的叶绿素含量下降幅度最小，为5.82%，‘华硕’的下降幅度最大，为32.29%，叶绿素含量排在前3位的为‘华夏’、‘鲁槐1号’、无性系564，与已推广良种‘鲁槐1号’差异不显著。此时，苗木还能正常生长。在4‰处理下，‘嫣红3号’叶绿素含量下降幅度最小(16.17%)，无性系564下降幅度最大(35.30%)，叶绿素含量排在前3位的为‘嫣红3号’、‘鲁槐1号’、‘华硕’。在6‰处理下，叶绿素含量最大的为‘华夏’。‘嫣红3号’叶绿素含量下降幅度最小(39.16%)，无性系564下降幅度最大(48%)，NaCl胁迫的抑制作用达到最大。

图4 NaCl胁迫对叶绿素含量的影响

2.5 NaCl胁迫对MDA含量的影响

随着NaCl处理浓度的增加，各无性系的丙二醛含量均呈上升趋势（图5）。与对照相比，在2‰处理下，5个国槐无性系的增幅均在500%以上，MDA含量较低的为‘华硕’、‘嫣红3号’、‘华夏’，与‘鲁槐1号’差异显著。在4‰NaCl处理下，5个国槐无性系的增幅明显增大，MDA较低的为‘华硕’、‘华夏’、‘嫣红3号’，与‘鲁槐1号’差异显著。在6‰处理下，5个国槐无性系的增幅明显增大，MDA最低的为‘华夏’，与‘鲁槐1号’差异显著。在2‰和4‰NaCl处理下MDA含量一直较低的‘华硕’在6‰处理下急剧增长，表明‘华硕’并不耐高盐。

图5 NaCl胁迫对MDA含量的影响

2.6 NaCl胁迫对SOD活性的影响

随着NaCl处理浓度的增加，各无性系的SOD活性均呈现出先增大后减小的趋势（图6）。与对照相比，在2‰NaCl处理下，5个国槐无性系的SOD活性达到最大，与对照相比，增幅由大到小依次为‘华夏’、‘华硕’、‘嫣红3号’、‘鲁槐1号’、无性系564。在4‰和6‰NaCl处理下，SOD活性出现下降，‘鲁槐1号’和‘华硕’活性较大，高于‘嫣红3号’、‘华夏’和无性系564。

图6 NaCl胁迫对SOD活性的影响

2.7 NaCl胁迫对CAT活性的影响

由图7可以看出，在不同浓度NaCl处理下，国槐叶内CAT活性较对照有明显增长，在胁迫初期CAT活性随处理浓度的增加呈上升趋势，且‘华夏’和‘鲁槐1号’在4‰盐浓处理下活性值达到最大，而后其活性呈下降趋势，而无性系564和‘华硕’在2‰和4‰NaCl处理下活性值相当，推测这2个无性系的CAT活性值高峰应出现在2‰到4‰值高峰应处理之间，‘嫣红3号’的CAT在2‰处理下达到最高值。由此推测，‘嫣红3号’、无性系564和‘华硕’比‘华夏’和‘鲁槐1号’更早在CAT活性值上达到高峰，在耐盐抗逆方面不如后者。

图7 NaCl胁迫对CAT活性的影响

2.8 NaCl胁迫对POD活性的影响

由图8可以看出，在不同浓度NaCl处理下，国槐叶内POD活性呈先增长后下降的趋势，在胁迫初期POD活性随处理浓度的增加呈上升趋势，在4‰处理下活性值达到最大，而后其活性呈下降趋势，说明4‰处理是国槐能承受的最大阈值。在4‰处理下，‘华夏’和‘鲁槐1号’POD活性值最大。在6‰NaCl处理下，‘华硕’活性值最低，且与其他无性系差异显著，由此推测，‘华夏’和‘鲁槐1号’在耐盐抗逆性方面优于其他无性系，且‘华硕’比其他无性系不耐高盐。

图8 NaCl胁迫对POD活性的影响

2.9 NaCl胁迫对细胞膜透性的影响

随着NaCl处理浓度的增加，各国槐无性系的细胞膜透性均表现出逐渐升高的趋势（图9）。在4‰处理下，5个国槐无性系的膜透性与对照相比明显增大，除‘嫣红3号’外其他国槐增幅均在61%以上。‘嫣红3号’、‘华硕’膜透性较低，与其他无性系差异显著。在6‰NaCl处理下，各国槐无性系的膜透性达到最大，‘华硕’膜透性最高，是最低‘华夏’的1.21倍，膜透性较低的为‘华夏’和‘嫣红3号’，与其他国槐无性系差异显著。

图9 NaCl胁迫对细胞膜透性的影响

2.10 NaCl胁迫对脯氨酸含量的影响

随着NaCl处理浓度的增加，各国槐无性系的脯氨酸含量均呈上升趋势（图10）。在2‰处理下，5个国槐无性系的脯氨酸含量差异并不显著。在4‰NaCl处理下，‘鲁槐1号’、‘华硕’、‘嫣红3号’脯氨酸含量最高，显著高于其他无性系。在6‰NaCl处理下，‘华夏’、‘华硕’脯氨酸含量最高，与其他无性系差异显著。

图10 NaCl胁迫对脯氨酸含量的影响

2.11 各指标的相关性分析

对6‰NaCl处理下的5个无性系各项指标进行相关性分析，结果（表1）表明，苗高增长量与生物量、叶绿素、MDA、脯氨酸呈相关性，MDA与细胞膜透性、SOD、POD、生物量呈相关性，脯氨酸与CAT呈相关性。生长指标和生理指标之间以及生理指标和生理指标之间都存在明显的相关性，因此，在研究植物应对盐胁迫的适应机制时应将两者联合起来进行综合评价。

表1 各指标相关性分析

2.12 主成分分析

用5个无性系的10个生长及生理生化指标进行主成分分析，对各无性系的耐盐碱能力进行综合评价。由表2可知，在4‰NaCl处理和6‰NaCl处理时，3个主成分的累积贡献率分别为91.597%和94.306%。

表2 耐盐指标主要特征值及贡献率

根据各性状对应的特征向量值可知，在4‰NaCl处理下，对第1主成分影响较大的为地径增长量、生物量、POD活性值这3个性状，其特征向量值分别为0.897、0.936和0.873，且都为正相关。对第2主成分影响较大的为苗高增长量、SOD活性值以及细胞膜透性这3个性状，其特征向量值分别为0.764、0.741和-0.809，其中苗高增长量、SOD活性值为正相关，细胞膜透性为负相关。对第3主成分影响较大的为MDA活性值、SOD活性值以及CAT活性值这3个性状，其特征向量值分别为0.499、0.569和0.716，都为正相关。在6‰NaCl处理下，对第1主成分影响较大的为地径增长量、生物量、叶绿素含量3个性状，其特征向量值分别为0.980、0.922和0.940，且都为正相关。对第2主成分影响较大的为SOD活性值，它的特征向量值为0.840，为正相关。对第3主成分影响较大的有地径增长量和POD活性值，这2个性状的特征向量值为0.431和0.402，都为正相关。

由表3得出，在4‰NaCl处理下，根据3个主成分值的大小得到各无性系的耐盐碱能力由强到弱为‘华硕’、‘华夏’、‘鲁槐1号’、无性系564、‘嫣红3号’。在6‰NaCl处理下，根据3个主成分值的大小得到各个无性系的耐盐碱能力由强到弱为无性系‘华夏’、‘鲁槐1号’、‘华硕’、无性系564、‘嫣红3号’。‘华夏’和‘华硕’耐盐性明显高于其他无性系，适宜在盐碱地推广应用，可作为城市生态绿化建设国槐首选品种。

表3 主成分值

3 结论

研究结果表明，各无性系耐盐性由强到弱为‘华夏’＞‘华硕’＞‘鲁槐1号’＞‘嫣红3号’＞无性系564。国槐幼苗中的SOD、POD和CAT活性变化趋势为先上升后下降，在土壤盐分质量浓度为2‰时，SOD活性达到最大值，在4‰时POD和CAT活性达到最大值，可以认为国槐所能承受的盐胁迫临界浓度在2‰～4‰之间，超过这个浓度就构成了盐胁迫，这对增强国槐抗氧化性能有积极意义，为后期进行国槐幼苗抗盐性锻炼提供了依据。

在本研究中，为综合评价5个无性系的耐盐性，使用了10个指标（生长指标及生理生化指标）来进行综合评价，但要想得到较为全面的评价结果还应考虑植物内源激素含量、根系活力、根尖阳离子流变化等多方面因素。同时，笔者是以两根一干的嫁接苗盆栽数据为基础进行的耐盐性研究，林木的生长受到各种因素的影响，其对环境的相应和适应性在不同时期会发生变化，因此成年树木的实际耐盐能力如何，还需进一步检验。

4 讨论

非生物胁迫下，植物的形态结构、渗透调节物质和抗氧化酶系统等生理生化指标、离子浓度及蛋白和基因等方面都会做出响应。其中，最直接的表现就是生长量和生物量的抑制[22]。因此，生长指标被认为是评价育种材料耐盐碱能力的最直接的鉴定指标[23]。本研究中，利用苗高增长量、地径增长量、生物量3个生长指标对5个无性系进行排序，‘华夏’和‘华硕’均排在前2位，为耐盐性较好的无性系。

植物细胞质膜是细胞与外界环境的一道分界面，对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要作用。当植物器官在遭受逆境伤害时，会首先作用于这层由类脂和蛋白质构成的生物膜，其表现往往为细胞膜透性增大，细胞内部分电解质外渗，因此，在盐胁迫下，细胞膜透性增加的越少，说明植物的耐盐性越强。本实验中，5个国槐无性系的细胞膜透性都持续增强，这与林雪峰[24]对3种滨海植物的研究结果一致。在6‰NaCl处理下，‘华夏’和‘华硕’的膜透性明显低于其他3个无性系，具有较强的耐受性，为耐盐性较强的无性系。

盐渍、干旱、高低温等逆境胁迫都会影响植物对水分的吸收而造成细胞水分亏损，这时植物细胞就会通过主动形成渗透调节物质来提高溶质浓度，降低细胞内水势，以利于从外界获得水分，提高植物对逆境的抗性来适应环境。脯氨酸就是一种理想且重要的有机渗透调节物质，它分子量小、水溶性高，在生理pH范围内无静电荷，以游离状态存在于植物体内且毒性低[25]。在盐渍胁迫下，植物会迅速积累脯氨酸并进行渗透调节，以维持细胞一定的含水量和胞内膨压，来增强自身的耐盐能力和抗逆性。Kemble等[26]于20世纪中期首次在受旱的多年生黑麦草叶片中发现了游离脯氨酸的积累。刘旻霞以6种甘南亚高山草甸植物为研究样本，分析发现随着逆境胁迫的加剧，6种植被叶片内脯氨酸含量都有不同程度的增加；而且不同的植物品种之间脯氨酸含量的增加幅度也有差异，认为叶片内脯氨酸含量的高低可作为衡量植物抗逆性的指标[27]。脯氨酸累积可以提高渗透胁迫耐受性，Furlan等[28]通过对2个耐旱性差异较大的花生品种进行研究发现，脯氨酸生物合成基因在水分胁迫下都有增加，而脯氨酸分解代谢基因的相对表达量在胁迫过程中仅在敏感品种中增加，进一步了解了脯氨酸在逆境保护中的作用。在本研究中，‘华夏’和‘华硕’的脯氨酸含量在6‰NaCl处理下，显著高于其他无性系，具有更强的渗透调节能力以适应盐胁迫环境。

植物在遭受盐胁迫或者其他环境胁迫时，体内活性氧代谢增强，产生的过量过氧化物自由基会对细胞膜造成伤害，进而造成蛋白质、脂膜和其他细胞组分的损伤，由此植物自身会相应地提高抗氧化酶的活性，消除活性氧，减轻逆境条件下活性氧对植物的伤害。植物体内的抗氧化酶一般包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)，这些抗氧化酶组成了植物体内的酶促清除系统，在清除过量的自由基和过氧化物、抑制膜脂质过氧化、保护细胞免遭自由基伤害等方面起着重要作用[29]。其中，SOD可以催化O2-发生歧化反应生成O2和H2O2，是植物体内活性氧自由基清除系统的第一道防线；POD主要清除植物体内因逆境产生的和SOD催化反应产生的过量H2O2；CAT则主要分解和清除植物体内的过氧化氢自由基。丙二醛(MDA)是质膜过氧化产物[30]，其含量高低在一定程度上反映了植物细胞膜的受损害程度[31]。在本实验中，NaCl胁迫下，国槐体内SOD、POD、CAT活性都是随着NaCl浓度的增高呈现先上升后下降的变化趋势，并且SOD首先在2‰胁迫下达到顶峰，POD、CAT则是在4‰NaCl胁迫下达到顶峰。这是由于国槐体内活性氧的主要代谢途径是由SOD催化超氧自由基，再由POD和CAT共同协作来清除SOD催化O2-的产物，这也就解释了SOD比POD和CAT更早出现活性值高峰。同时在相关性分析中，MDA含量与SOD活性呈现显著正相关，这与两者参与的代谢过程一致相关。

叶绿素是植物细胞叶绿体的重要组成部分，具有吸收、传递和转换光能的功能，在植物进行光合作用的过程中发挥着重要的作用。植物受到盐胁迫时，叶绿素的合成受到影响，而叶绿素的降解进程加快，从而使叶绿素的含量降低，进而影响到植物的生长发育，所以，叶绿素含量可以辅助评价植物无性系耐盐性的高低。本实验中，5个国槐无性系的叶绿素含量均随着NaCl处理浓度的增大而降低，这与杨传宝等对白杨派无性系的研究结果一致[32]。在3种浓度的NaCl处理下，叶绿素含量下降幅度最小的为‘华夏’和‘华硕’，表现出较高的耐盐性。