竹叶花椒黄酮类成分含量及抗氧化活性相关性分析

杨 悦，冯靖雯，陈鸿平，刘友平

成都中医药大学药学院 西南特色中药资源国家重点实验室，成都 611137

竹叶花椒是芸香科植物竹叶花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)的干燥成熟果皮，性辛、温，具有温中止痛、杀虫止痒等功效，俗称“藤椒”，又名万花针、白总管、竹叶总管、山花椒等，主要分布在我国秦岭以南的广大西南区域[1,2]。目前四川省栽种面积达300多万亩[3]，形成川中、川西、攀西3个花椒特色优势种植区，攀西及川中地区为竹叶花椒集中地[4]。

基于清香浓郁的特殊风味，竹叶花椒在餐饮行业流通广泛，常用作风味调节剂和防腐剂，防腐作用与抗氧化活性物质相关[5]。现代药理学研究表明，竹叶花椒具有镇痛抗炎、保肝、抗氧化、驱蚊杀虫、抗肿瘤、降血糖、抗阿兹海默症[6-12]等作用，其中保肝、抗肿瘤、降血糖等药效作用与竹叶花椒抗氧化活性有关，目前未有研究表明竹叶椒药材抗氧化活性与其传统功效有关联。本课题组前期研究表明，竹叶花椒不同极性部位均具有清除DPPH、ABTS及羟基自由基作用。有文献报道，不同产地的竹叶花椒均具有较好的抗氧化活性[13]，且自由基清除率、总抗氧化活性和还原电位实验，三种实验方法均表明抗氧化作用与提取物剂量呈正相关[14]。藤椒水提液有很好的抗氧化活性，可能与黄酮类成分的芦丁、槲皮素等有关[15]。目前关于不同产地竹叶花椒黄酮类成分含量差异及其与抗氧化活性相关性的研究较少。因此，本文收集四川川中、攀西等21个产地的27批竹叶花椒，建立HPLC方法同时测定4种黄酮类成分，紫外测定总黄酮含量，结合DPPH、ABTS自由基清除试验评价不同产地竹叶花椒抗氧化活性差异。通过皮尔逊相关分析法，探究黄酮成分和抗氧化活性的相关性，旨在为竹叶花椒抗氧化活性研究与大健康衍生品开发提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Agilent 8453紫外分光光度计(美国Agilent公司)；BN3000型万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；CP2000型十万分之一电子天平(德国Sartorius公司)；UPTUO-I-1000TE优普系列超纯水机(成都纯水科技有限公司)；SG8200HDT型超声波清洗机(上海冠特超声仪器有限公司)；Varioskan flash型酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司)。

1.2 材料

芦丁(批号：AF9022006，纯度：98%)、金丝桃苷(批号：AF9110614，纯度：98%)、槲皮苷(批号：AF20030853，纯度：98%)、异槲皮苷(批号：AF9030801，纯度：98%)均购自成都埃法生物科技有限公司；乙腈、甲醇(色谱级，美国TEDIA有限公司)；甲酸(分析级，成都金山化学试剂有限公司)；95%乙醇(分析级，成都市科隆化学品有限公司)；过硫酸钾、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠(成都市科隆化学品有限公司)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，上海麦克林生化有限公司)；2,2-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS，上海麦克林生化有限公司)；L-抗坏血酸(大连美仑生物技术有限公司)；竹叶花椒样品来源信息见表1，经成都中医药大学严铸云教授鉴定为芸香科植物竹叶花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)的干燥成熟果皮。

表1 27批竹叶花椒样品来源信息Table 1 Source information of 27 batches of Z.armatum

续表1(Continued Tab.1)

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定[16]

2.1.1 对照品溶液制备

精密称取芦丁对照品5.43 mg，加甲醇制成1 mL含芦丁0.543 mg的溶液作为对照品储备液。

2.1.2 供试品溶液制备[17]

将竹叶花椒粉碎，过3号筛，精密称定花椒样品粉末约1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称重，超声提取30 min，称重，用甲醇补足重量，过滤，取续滤液0.1 mL置10 mL容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液0.4 mL，摇匀；放置6 min后，再加入10%的Al(NO3)3溶液0.4 mL，摇匀；再放置6 min后，加入1 mol/L的NaOH溶液4 mL，15 min后甲醇定容。

2.1.3 最大吸收波长的选择

以甲醇按供试品制备方法制备为空白溶液，取供试品溶液在400～800 nm之间扫描，根据扫描结果选择510 nm作为测定波长。

2.1.4 标准曲线的制备

精密称取对照品溶液0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2 mL至10 mL容量瓶，以甲醇为空白，在510 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程：y= 11.835x+ 0.0213，R2= 0.999。

2.1.5 样品含量的测定

取不同产地竹叶花椒样品，按“2.1.2”项下制备溶液，在510 nm处测定吸光度，根据线性回归方程计算不同产地竹叶花椒中总黄酮含量。

2.2 4种黄酮类成分测定

2.2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷对照品适量，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，混匀，得到浓度分别为0.1、0.2、0.062、0.154 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取竹叶花椒粉末(过3号筛)约1 g，精密称定，加25 mL甲醇，超声(500 W，30 kHz)30 min，放冷，称重，用甲醇补重，过滤，取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.2.3 色谱条件

采用ZORBAX SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～5 min，10% B；5～10 min，10%→17% B；10～25 min，17% B；25～30 min，17%→20% B；30～45 min，20% B；45～50 min，20%→30% B；50～55 min，30%→40% B；55～60 min，40%→58% B；60～65 min，58%→100% B)；流速为1.0 mL/min；柱温为35 ℃；检测波长为360 nm；进样量为10 μL。混合对照品溶液及竹叶花椒样品溶液的HPLC色谱图见图1。

图1 混合对照品溶液(A)及样品溶液(B)HPLC色谱图Fig.1 HPLC of mixed reference (A) and test (B) solution 注：1-芦丁；2-金丝桃苷；3-异槲皮苷；4-槲皮苷。Note:1-Rutin;2-Hyperoside;3-Isoquercitrin;4-Quercetin.

2.2.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液0.5、1、2、4、6、8、10 μL，分别进样，记录HPLC色谱图。以对照品的质量浓度(X，mg/mL)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程，结果见表2。

表2 竹叶花椒中4种黄酮成分的线性关系考察Table 2 Linear relationship of four flavonoids in Z.armatum

2.2.5 方法学考察

2.2.5.1 精密度试验

在“2.2.3”色谱条件下，对同一对照品溶液重复6次进样进样量10 μL，计算芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷峰面积的RSD值分别为0.50%、0.54%、0.50%、0.62%，表明仪器精密度良好。

2.2.5.2 重复性试验

取同一批竹叶花椒6份，制备成供试品溶液，在“2.2.3”色谱条件下进样，计算芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷峰面积的RSD值分别为1.79%、1.88%、1.65%、4.13%，表明方法重复性良好。

2.2.5.3 稳定性试验

取竹叶花椒供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h，按“2.2.3”色谱条件下进样，计算芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷峰面积的RSD值分别为2.24%、1.91%、2.41%、3.09%，结果见表3，表明芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷在24 h内稳定性良好。

表3 竹叶花椒中4种黄酮成分稳定性试验结果Table 3 Stability test results of four flavonoids in Z.armatum

2.2.5.4 加样回收率试验

取一批竹叶花椒样品6份，精密称定，加入适量对照品溶液，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件进样测定并计算芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷平均回收率分别为100.97%、101.21%、99.24%、99.01%，RSD值分别为1.31%、3.87 %、3.24%、1.98%，结果见表4。

表4 竹叶花椒中4种黄酮类成分加样回收试验结果Table 4 Results of recovery test of four flavonoids from Z.armatum

续表4(Continued Tab.4)

2.2.6 样品的含量测定

取不同产地竹叶花椒样品，按“2.2.2”项下制备样品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件进样测定，根据外标一点法计算不同产地竹叶花椒中4种黄酮类成分含量结果见表5。

表5 27批竹叶花椒样品中黄酮成分含量Table 5 Contents of flavonoids in 27 batches of Z.armatum(mg/g，n = 3)

续表5(Continued Tab.5)

不同批次竹叶花椒总黄酮、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷的含量测定结果见表5，不同产地的总黄酮及4种黄酮类成分含量存在较大差异。其中，凉山盐源(s3)竹叶花椒金丝桃苷、异槲皮苷含量最高，凉山布拖(s8)的4种黄酮类成分含量总量(TL)最低，由此可知，凉山州竹叶花椒黄酮含量差异较大。巴中平昌(s19)的芦丁和槲皮苷含量最高，巴中通江(s12)总黄酮含量最高。乐山夹江(s14)的总黄酮含量最低，且4种黄酮类成分含量总量(TL)较低。

2.3 抗氧化活性测定

2.3.1 供试品溶液的制备

按照“2.1.2”项下的方式制备供试品原液，再分别制成浓度为0.004、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.48 mg/mL的溶液。

2.3.2 Vc溶液制备

精密称取L-抗坏血酸(Vc)5.06 mg，置于10 mL容量瓶中，加95%乙醇溶解，定容，摇匀，即得Vc原溶液浓度为0.506 mg/mL。再分别制成浓度为0.000 506、0.001 265、0.002 53、0.005 06、0.006 325、0.012 65、0.025 3 mg/mL。

2.3.3 DPPH溶液的配制

精密称取DPPH 2.02 mg，置于50 mL容量瓶中，加95%乙醇溶解，定容，摇匀，即得DPPH溶液(浓度为0.040 4 mg/mL)。

2.3.4 ABTS溶液的配制[13]

将ABTS配制成6.94 mmol/L水溶液，将K2S2O8配制成2.6 mmol/L水溶液，在使用前将二者混合溶液置于阴凉处12～16 h，使两者发生完全充分的反应。然后用95%乙醇稀释原溶液，在波长734 nm处检测，直到最终测得的吸光度值在0.70±0.02之间，即完成ABTS+溶液的配制。

2.3.5 DPPH清除率计算

96孔板加入样品后置于阴暗处反应1 h后使用Varioskan Flash酶标仪测定OD值，测定波长选择517 nm。DPPH清除率计算公式如下：

式中：A0表示100 μL DPPH溶液+100 μL 95%乙醇的吸光度值；A1表示100 μL DPPH溶液+100 μL供试品/Vc溶液的吸光度值；A2表示100 μL供试品溶液溶液+100 μL 95%乙醇的吸光度值。

2.3.6 ABTS清除率计算

96孔板加入样品后置于阴暗处反应40 min后使用Varioskan Flash酶标仪测定吸光度OD值，测定波长选择750 nm。ABTS清除率计算公式如下：

式中：A0表示25 μL 95%乙醇+175 μL ABTS+的吸光度值；A1表示25 μL样品+175 μL ABTS+的吸光度值；A2表示25 μL样品175 μL 95%乙醇的吸光度值。

2.3.7 相关性分析

采用Graphpad prism 7.0软件[18]，预测出EC50值，结果见表6。

由表6可知，不同产地花椒甲醇提取物对DPPH、ABTS自由基清除能力具有一定差异。其中，巴中通江(s12)对DPPH自由基的清除能力最高，绵阳三台(s15)对ABTS自由基的清除能力最高，但清除率均低于对照组。

表6 DPPH和ABTS法测定的27批竹叶花椒的EC50值Table 6 EC50 of 27 batches of Z.armatum determined by DPPH and ABTS methods

皮尔逊相关系数被用于衡量2个变量之间的线性关系[19]，应用IBM SPSS Statistics 23 软件对27批不同产地竹叶花椒甲醇提取物中总黄酮、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷成分含量分别与DPPH自由基清除率的EC50值、ABTS自由基清除率的EC50值计算皮尔逊相关系数。结果见表7，总黄酮和芦丁与DPPH、ABTS自由基清除率的EC50值均呈显著负相关性，表明总黄酮与芦丁可作为评价竹叶花椒抗氧化能力的指标之一。芦丁含量与总黄酮含量相关系数较高(相关系数≥0.6)，存在较高一致性。

表7 黄酮类物质与抗氧化性相关系数Table 7 Correlation coefficient between flavonoids and antioxidant activity

3 讨论与结论

本研究采用HPLC法同时测定竹叶花椒中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷成分含量，采用分光光度计测定总黄酮含量，比较不同产地黄酮类成分含量差异。结果显示，总黄酮含量范围为30.460 7～90.173 1 mg/g，巴中市通江县(s12)总黄酮含量是乐山市夹江县(s14)总黄酮含量3倍，金丝桃苷含量范围为0.442 7～3.983 2 mg/g,凉山州盐源县(s3)金丝桃苷含量超过凉山州布拖县(s8)含量近10倍，凉山州盐源县(s3)四种黄酮类成分含量总和(TL)是布拖县(s8)的5倍，不同产地的总黄酮及4种黄酮类成分含量存在较大差异。

采用DPPH、ABTS自由基清除法试验，对21个产地的川产竹叶花椒的抗氧化活性进行分析，并采用皮尔逊双变量相关分析对黄酮成分和抗氧化活性进行相关性分析。结果表明，不同产地竹叶花椒抗氧化活性存在较大差异。巴中通江(s12)对DPPH自由基的清除能力最高，相对其他地区，3批巴中竹叶花椒甲醇提取物对DPPH的清除能力均较高，与黄酮含量测定结果一致，但绵阳三台对ABTS自由基的清除能力最好，表明不同体外抗氧化活性试验结果存在差异。

相关性分析结果，芦丁含量与总黄酮含量存在较高一致性，因此，竹叶花椒中芦丁含量可作为总黄酮含量高低的评价指标。总黄酮和芦丁与DPPH、ABTS自由基清除率的EC50值呈显著负相关，说明竹叶花椒中总黄酮、芦丁抗氧化作用明显，Zhang[20]比较了芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖四种单体化合物的抗氧化活性，活性顺序为金丝桃苷>芦丁>异槲皮苷，目前未见文献报道槲皮苷的抗氧化活性，芦丁和金丝桃苷含量占4种黄酮类成分含量总和的57.8%～67.3%，因此，芦丁可作为评价竹叶花椒抗氧化活性的指标之一。

在测定竹叶花椒黄酮类成分含量中，不同产地总黄酮、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷与槲皮苷含量存在明显差异。查阅文献发现，影响因素较多[21]，由于本实验采集样品产地较集中，有一定的局限性，进一步研究将收集全国不同省份竹叶花椒样品，初步探索竹叶花椒抗氧化机制，为其大健康衍生品开发提供实验依据。