分子生物学技术在植物病毒检测中的应用

董芳娟 魏增云 薄一览

(忻州师范学院，山西 忻州 034000)

植物病毒在全球范围内的危害越来越大，植物病毒能够导致农作物和经济作物发病，造成产量下降甚至绝收的情况出现，给农业带来极大的损失。近年来，发现的植物病毒种类越来越多，当前发现的植物病毒分为18个科，共76个属，总数量超过1000种。随着我国与国际贸易规模不断扩大，境外植物病毒通过口岸的输出风险不断扩大，因此加强植物病毒的检测效率和准确性就显得更为重要。为了防止植物病毒的危害，需要做好病毒预防和综合防治工作，而建立快速、高灵敏度、高通量的病毒检测体系是做好上述工作的前提。植物病毒的检测技术经历了多年发展，起初常用的检测技术包括生物学鉴定和电子显微镜技术，随后酶联免疫吸附反应成为植物病毒常用的手段。随着分子生物学的发展，在植物病毒检测领域，分子生物学方法已经获得了广泛的应用，包括核酸杂交技术、反转录PCR技术、荧光定量PCR技术和DNA微阵列技术等，本文对这几种技术及其在植物病毒检测领域的应用进行介绍。

1 核酸杂交技术

根据碱基互补配对原理，互补的核酸单链可以相互结合，核酸杂交技术就是利用了这一原理，通过对一段病毒特异的核酸序列进行标记，制成探针，将其和待测样品的核酸进行杂交，若发生杂交则表示病毒存在。这种方法可以应用于DNA、RNA病毒及类病毒的检测，该方法具有较高的灵敏度，同时还具有特异性强、通量高等方面的优点。在实际应用中，为了满足病毒检测的实际需求，既可以制备用于单一病毒检测的单特异性探针，也可以制备用于多种病毒检测的复合型探针。当前核酸杂交技术在植物病毒检测领域已经获得了广泛应用，包括核酸斑点杂交技术、核酸狭缝印迹杂交技术和Northem印迹等技术，在植物病毒检测方面都有重要应用。研究人员对核酸杂交技术在植物病毒检测方面的应用进行了大量的研究，Brown等对核酸斑点杂交技术、狭缝印迹技术和Northern印迹技在植物病毒检测中的应用方法进行了全面的介绍，详细描述了分析的过程和试验步骤，构建了完善的检测体系；Cohen等制作了一个针对柑橘树上啤酒花矮化类病毒、柑橘裂皮类病毒、柑橘曲叶类病毒和柑橘类病毒Ⅲ号的复合探针，该探针能够对上述病毒进行准确检测，具有较高的灵敏度和效率。核酸杂交技术还可以进行植物病毒的鉴定，通过应用反向斑点杂交技术对待测样品的病原物进行杂交，可以对病毒进行鉴定，如Hsu等就利用这一技术实现了马铃薯Y病毒组病毒的鉴定。

2 反转录聚合酶链式反应

反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术能够完成多数植物病毒的检测和诊断，该检测方法的步骤和原理是进行RNA的反转录，使其转录成cDNA；通过1对特异性引物来进行PCR反应，对植物病毒进行检测；引物的设计是该方法的重点，可以根据病毒核酸基因组序列来进行引物设计。研究人员对RT-PCR技术在植物病毒检测中的应用进行了大量研究，Aparieio等通过应用RT-PCR对油桃中的李坏死环斑病毒进行了检测，根据病毒的特异性和旋基因组序列设计了一堆特异性引物。通过RT-PCR扩增得到特异性产物，实现了李坏死环斑病毒的检测，同时该实验表明，花粉粒也能够传播病毒；Uga等采用RT-PCR完成了菜豆黄花叶病毒的检测，该方法在获得样品的提取液之后，对粗汁液进行稀释，然后进行电泳，最终得到了1条644bp的特异性条带，完成了病毒检测。实验结果显示，在稀释106倍之后，稀释液中仍然可以检测出病毒，说明该方法具有非常好的灵敏度；Grisoni等应用RT-PCR方法对香草中的马铃薯Y病毒进行检测，其对40个香草样品进行检测，结果发现有36个样品在327bp处出现了特异性条带，即有36个香草样品中携带了马铃薯Y病毒。当前，RT-PCR技术还在不断发展之中，研究人员对RT-PCR技术进行了创新和改进，出现了一些新的RT-PCR技术，包括嵌套式RT-PCR技术、免疫捕获RT-PCR技术和多重RT-PCR技术等，这些技术在植物病毒检测中都有重要应用，现对这几种技术的研究进行简单介绍。在嵌套式RT-PCR技术研究方面，Morris等应用这一技术实现了甜菜坏死黄脉病毒的检测，相较于传统的RT-PCR技术，这一技术的灵敏度高得多，可以达到传统RT-PCR技术的1000倍；Foissac等应用这一技术实现了果树中苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎沟病毒等7种病毒的检测，该实验表明，嵌套式RT-PCR技术在同时检测多种病毒方面具有良好的效果。免疫捕获RT-PCR技术研究方面，Cook等应用这一技术实现了花生褪绿黑斑病毒的检测，该方法的具体流程是应用马铃薯Y病毒属的单克隆抗体对PCR管进行包被，并对样品进行处理；然后将处理好的样品加入到PCR管内，捕获病毒作为模板进行反转录和PCR扩增，最终得到1条624bp的产物条带，成功检测了花生褪绿黑斑病毒。Teycheney等则综合应用了嵌套式RT-PCR技术和免疫捕获RT-PCR技术，通过这2项技术的联合应用，对香蕉轻型黄叶病毒进行了成功检测，该方法采用了抗BanMMV的多克隆抗体进行反应管的包被，并进行病毒的捕捉，然后以捕获的病毒为模板进行嵌套RT-PCR反应，成功实现了病毒的检测。在多种RT-PCR技术研究方面，Sanehez-Navarro等应用这一技术实现了8种核果类果树病毒的检测，应用该方法进行病毒检测，不仅具有较强的灵敏度，而且具有良好的特异性。总的来说，通过应用改进和创新了的RT-PCR技术，相较于传统的RT-PCR技术，在检测效率、灵敏度等方面都有不错的提升。因此，对RT-PCR技术进行进一步的研究，对于提高植物病毒的检测效率具有重要意义。

3 荧光定量PCR

荧光定量PCR技术是一种利用荧光实时信号，对整个PCR过程进行实时监测的PCR检测技术，该技术能够利用标准曲线实现未知模板的定量分析。荧光定量PCR技术是PCR检测技术重要的进步，该技术的出现使得PCR技术不仅仅是一项定性分析技术，而且可以进行定量检测。荧光定量PCR技术能够在反应管内进行，条件简单，可以用于大规模样品检测，同时该技术具有良好的特异性，受污染问题的影响小，而且该检测方法的自动化程度较高，因此该方法在病毒检测领域具有良好的应用前景。随着荧光定量PCR技术的发展，在植物病毒检测领域也获得了重要应用。如，Mukasa等利用荧光定量RT-PCR技术，对甘薯轻型斑驳病毒、甘薯褪绿矮化病毒和甘薯羽状斑驳病毒在甘薯植物中复合侵染及相互作用进行了鉴定；Bright等应用荧光定量PCR技术进行马铃薯块茎中的马铃薯A病毒、马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒的检测，实现了这些病毒的定量检测；Bertolini等应用荧光定量PCR技术实现了植物组织中柑橘速衰病毒的定量检测。该方法相较于免疫捕获RT-PCR技术，在灵敏度方面要高得多，可以达到免疫捕获RT-PCR技术的1000倍，因此这一技术具有良好的应用前景。郑耘等应用这一技术，实现了烟草环斑病毒的检测，该方法具有较高的灵敏度。

4 DNA微阵列技术

DNA微阵列技术是结合了众多学科的核酸固相杂交技术，该技术中应用了分子生物学、材料科学、信息科学和计算机科学等知识，当前这种技术在核酸序列测定、基因突变检测、基因表达情况分析、微生物病原菌检测、疾病诊断和药物开发和筛选等方面都有重要应用。在植物病毒领域，DNA微阵列技术也有着重要应用。最早应用DNA微阵列技术检测植物病毒的是Lee团队，该团队应用DNA微阵列技术对黄瓜绿斑驳病毒等引发葫芦科植物病毒病的病毒进行了检测，具有良好的特异性和灵敏度。马新颖等利用基因芯片技术，成功检测了郁金香中的烟草脆裂病毒，在该实验中，TEV探针位置产生了较强的荧光信号，表明该郁金香种含有烟草脆裂病毒。

5 PCR-单链构型多态性

PCR-单链构型多态性(PCR-SSCP)是一种检测突变技术，在不同地理区间下细菌、真菌以及病毒等的差异研究方面具有重要应用，该技术具有简单、快速和成本低等方面的特点。该技术的原理是进行靶DNA的PCR扩增，然后对单链DNA的多态性进行分析。在SS-CP凝胶中电泳时，单链DNA的二级空间结构将直接决定其泳动的速率，基于这一原理，如果DNA片段中有碱基出现了突变，则该DNA片段的二级空间结构也会发生变化，这样SS-CP的凝胶电泳结果会出现异常移动的电泳带；使DNA通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过对其电泳位置进行分析，可以判断出DNA片段上出现突变的碱基。这种方法也存在一定的缺陷，即其重现性比较差，因此检测结果并不稳定，同时也无法实现全部变异点位的检测。相关学者对PCR-SSCP的实际应用进行了研究，如刘升学等利用这一方法对新疆甜菜坏死黄脉病毒进行了检测，研究显示，来自新疆不同地区的病毒可以分析4个变异类型，即在新疆地区甜菜坏死黄脉病毒出现了分化，且这种分化具有明显的地域分布性。

6 差异显示PCR技术

差异显示PCR技术最早被提出是在1992年，这种技术的优点是快速、简单、灵敏度高，同时还能够完成低丰度mRNA的分析，由于具有这些方面的优点，使其在植物基因表达和克隆新基因等方面都获得了重要应用。当前，差异显示PCR技术已经成为研究基因表达的重要手段，这一技术的原理是利用一系列的引物来实现真核生物中全部表达mRNA的逆转录，然后利用PCR扩增转换成cDNA，利用凝胶电泳实现具有差异的DNA片段的分离，从而完成目的基因的筛选。当前，差异显示PCR技术在植物病毒检测方面也有重要应用，还可以通过其对抗病机理进行研究。如，Benito等就应用差异显示PCR技术对番茄真菌病害的机理进行了分析，研究结果表明，受到真菌侵染或者是遭到烟草枯斑病毒感染的番茄叶，与健康番茄叶相比，mRNA存在比较大的差异。植物被病菌入侵之后，植物防卫基因会产生一系列的mRNA，然后产生蛋白来杀灭病菌；叶楠等应用差异显示PCR技术对大豆疫霉根腐病菌进行了研究，选择46种优良大豆品种和大豆疫霉生理优势小种1号菌株进行研究，研究其非亲和互作中前后基因表达的差异，通过相关研究，从大豆基因中分离出9条与大豆疫霉根腐病抗病性相关的cDNA片段，同时对大豆疫霉根腐病菌的分子抗病机制进行了进一步的分析，明确了抗病机制。

7 结语

植物病毒会导致农作物和经济作物发病，造成减产甚至绝收，给农业带来巨大损失。因此，加强植物病毒的防范非常重要，而对植物病毒进行检测是进行植物病毒防治的基础。随着分子生物学技术的发展，其在植物病毒检测领域得到了广泛的应用，核酸杂交技术、反转录PCR、荧光定量PCR、DNA微阵列等分子生物学检测技术在植物病毒检测中应用越来越多，该技术具有检测速度快、特异性好、灵敏度高和通量高等特点，对于提高植物病毒检测的效率和准确性具有重要意义，可以准确、高效地完成植物病毒的检测。