大承气汤治疗急性肺损伤的主要活性成分及潜在靶点研究

王蕴涵， 杜群， 李燕舞， 肖苏婷， 乔杨

（广州中医药大学科技创新中心，广东广州 510405）

急性肺损伤（acute lung injury）是由感染、创伤、有害气体吸入、休克、中毒等多种因素所导致的以肺弥散功能障碍为特征的肺部疾病[1]，在临床中病死率较高，常危及生命[2]。目前，除了传统的治疗原发病、呼吸支持及使用糖皮质激素外，国内外关于其生理病理机制的研究也在不断开展，旨在为急性肺损伤提供更好的治疗方法。中医学并无“急性肺损伤”这一疾病名称，而是根据其发病时的症状、体征将其归属于“喘脱”“结胸”“暴喘”等病证的范畴[3]。临床上急性肺损伤患者多为阳明燥实，热毒结于大肠，腑气不通，形成阳明腑实之证，基于中医藏象理论“肺与大肠相表里”“肺合大肠”，临床上多采用肺肠同治之法[4]。大承气汤出自《伤寒论》，是肺肠同治法临床应用的代表方剂，被广泛应用于急性肺损伤的治疗，效果显著[5-8]；但其作用机制尚不清楚。因此，本研究通过网络药理学的方法初步探讨大承气汤治疗急性肺损伤的主要活性成分及潜在靶点，并加以体外实验验证，以期阐明其作用机理。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 网络药理学预测

1.1.1 大承气汤药物化学成分收集及药物靶点预测登录中药系统网络药理学数据库选择TCMSPTM（网址http:∕∕ibts.hkbu.edu.hk∕LSP∕tcmsp.php），设置搜索条目为Herb name。设置筛选条件为口服生物利用度（OB）≥30%、类药性指数（DL）≥0.18，筛选大承气汤的目标靶点（targets information）。数据库所获得的药物有效化学成分及靶点信息应用Drugbank（https:∕∕www.drugbank.ca∕）使 其 格 式 标 准化。因TSMSP数据库中尚未收录芒硝的药物成分及靶点，登录BATMAN数据库（网址：http:∕∕bionet.ncpsb.org.cn），在搜索条目下以“mang xiao”为关键词搜索，收集芒硝的药物成分靶点。

1.1.2 疾病靶点来源登录GeneCards人类基因数据库[9]（THE HUMAN GENE DATABASE），网址https:∕∕www.genecards.org∕。设置搜索条目为关键词搜索人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man）[10]，网 址https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕omim。搜索条目下以“acute lung injury”为关键词筛选，设置物种为人（Homo sapiens），获取急性肺损伤的疾病靶点。对数据库检索到的疾病靶点进行合并去重，作为最终的疾病靶点来源。

1.1.3 复方-疾病交集基因的获取应用R语言中的在线程序Draw Venn Diagrams对“1.1.1”项与“1.1.2”项中获取到的大承气汤药物靶点与急性肺损伤疾病靶点进行匹配，获得交集基因靶点，作为大承气汤治疗急性肺损伤的潜在作用靶点并绘制韦恩图。

1.1.4 化学成分-靶点网络图的构建将“1.1.3”项中获取到的交集基因导入到网络可视化软件Cytoscape 3.8.0，构建化学成分-靶点作用网络。对网络进行分析，以度值参数作为评价节点在网络中重要性的标准。

1.1.5 大承气汤治疗急性肺损伤的蛋白相互作用（PPI）网络构建及核心蛋白筛选登录String数据库，网 址https:∕∕string-db.org∕。选 择Multiple proteins，在搜索条目下输入“1.1.3”项获取到的交集基因，限定物种为人（Homo Sapiens），其余设置保持不变，构建PPI功能网络，并绘制网络图。为筛选核心蛋白，将生成的PPI条目Node1、Node2以及Combined-scorce导入到Cytoscape3.8.0，应用Network Analyse插件分析网络，选择APP条目下的CytoNCA插件进行网络拓扑分析。

1.1.6 基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科（KEGG）通路富集分析基于R语言对“1.1.3”项中获取到的交集基因的细胞成分、分子功能、生物学过程以及信号通路进行富集分析。首先将基因Symbol转化为基因ID，选择物种为人（Homo sapiens），设定阈值为P＜0.05，输出富集结果并绘制条形图与气泡图。

1.2 体外实验验证

1.2.1 药物、试剂与仪器木犀草素（luteolin）[高效液相色谱（HPLC）>98%，成都普菲德生物技术有限公司]；芦荟大黄素（aloe-emodin）（HPLC>97%，成都普菲德生物技术有限公司）；柚皮素（naringenin）（HPLC>99%，成都普菲德生物技术有限公司）。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（大肠杆菌055：B5）（美国Sigma-Aldrich公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒、小鼠白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）ELISA试剂盒（碧云天生物技术公司）；P53兔多克隆抗体（Protein-Tech Group公司）；GAPDH兔多克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）偶联的兔免疫球蛋白（IgG）抗体（ABCAM公司）。酶标仪（美国Thermo Fisher公司）。

1.2.2 细胞培养本实验选用小鼠单核巨噬细胞RAW264.7（购自上海中科院细胞库）。在实验开始前先把RAW264.7细胞放置于37℃、体积分数5%CO2的培养箱中，给予体积分数10%胎牛血清（FBS）DMEM培养基处理以提供必要的生长条件。培养2~3 d达到90%聚集，再以1∶5的比例传代培养用于实验。

1.2.3 MTT实验本研究采用MTT法分析评估木犀草素、芦荟大黄素、柚皮素对RAW264.7细胞活力的影响，并由此确定合理的药物浓度。首先将细胞以1×105个∕孔的密度接种在96孔板中，待细胞贴壁后，培养12 h，然后用含有不同浓度木犀草素、芦荟大黄素、柚皮素（0、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol∕L）的培养基处理细胞24 h。接着，将20μL MTT（5 mg∕mL）添加到每个孔中，于37℃中温育4 h后弃去培养基，于每个孔中加入100μL二甲基亚砜（DMSO）溶解已经形成的甲瓒晶体，应用酶标仪，选择最佳测量波长570 nm，测量每个孔的吸光度。

1.2.4 ELISA实验本研究采用ELISA法检测细胞培养基上清TNF-α和IL-6水平。根据实验需求将RAW264.7细胞以3×106个∕孔的密度接种在6孔板中，给予与“1.2.3”项相同浓度、时间的药物刺激，收集RAW264.7细胞培养基上清，根据说明书方法进行操作。最后应用酶标仪，选择最佳测量波长450 nm，测量每个孔的吸光度。

1.2.5 蛋白免疫印迹（Western Blot）实验同“1.2.4”项的细胞培养及刺激方式。去掉RAW264.7细胞培养基上清，使用预冷的PBS洗涤2次，加入结合蛋白酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液裂解处理后的RAW264.7细胞，提取总蛋白。通过8%~12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，并将蛋白转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，用50 g∕L脱脂牛奶封闭。将PVDF膜与P53抗体4℃孵育过夜后，再与HRP标记的IgG抗体孵育。应用GE ImageQuant LAS4000mini（美国GEHealthcare公司）观察目的条带，并应用Gel Doc XR系统（美国Bio-Rad Laboratories）采用光密度法定量，最后应用Quantity One蛋白质分析软件（美国Bio Rad公司）进一步分析。

2 结果

2.1 复方化学成分及药物靶点本次研究经过合并去重，共收集大承气汤药物化学成分27个，预测靶点82个。

2.2 疾病靶点的获取在GeneCards、OMIM数据库中以“acute lung injury”为关键词进行检索，通过R软件的venn程辑包将2个数据库中所得到的疾病靶点汇总并删除重复。为保证数据的准确性，GeneCards数据库按照Relevance Score＞10筛选，共获得2 801个疾病靶点，通过UniProt数据库对疾病靶基因进行校正，将其作为候选靶标来源。

2.3 获取复方-疾病交集基因基于R语言3.6.0软件，在R语言中Bioconductor（https:∕∕www.bioconductor.org∕）网站安装VennDiagram程辑包，将“1.1.1”项与“1.1.2”项中获得的复方药物靶点与疾病靶点数据导入到R软件，应用Draw Venn Diagrams在线程序获取交集基因并绘制韦恩图，见图1。共获得复方-疾病交集基因55个。

图1 大承气汤-急性肺损伤交集基因韦恩图Figure 1 Venn diagram of intersection between Dachengqi Decoction-acute lung injury

2.4 构建有效成分-靶点网络图运用Cytoscape 3.8.0软件中Import Network插件构建复方有效化学成分-靶点作用网络，见图2。网络共有145个节点，297条边。核心靶标显示为方形，活性化学成分显示为圆形，不同药物显示为不同颜色，其中，大黄显示为红色，芒硝显示为绿色，枳实显示为紫色，厚朴显示为蓝色。网络中化合物与靶点的关系用每条边来显示。一个化学成分与多个交集基因靶点对应，且一个交集基因与靶点也同时对应多个化学成分，化学成分又从属于不同的中药，这说明大承气汤治疗急性肺损伤的过程是多成分、多靶点的。

图2 大承气汤化学成分-靶点作用网络Figure 2 Active ingredient-target network of Dachengqi Decoction

2.5 核心蛋白相互作用网络构建及核心蛋白筛选应用String数据库对交集基因初步构建蛋白作用网络，见图3。节点代表蛋白，边代表蛋白与蛋白之间的作用关系。网络连接程度越高说明蛋白之间关系越密切。将String数据库得到的string_interactions.txt文件导入到Cytoscape 3.8.0软件，应用Network Analyse插件构建网络，选择CytoNCA插件进行网络拓扑分析，筛选网络中的关键节点。核心蛋白筛选参数：介度中心性（Betweenness Centrality），紧密中心性（Closeness Centrality），节度中心性（Degree Centrality），特征向量（Eigenvector Centrality），局 部 连 通 性（Local Average Connectivity-based method，LAC）。筛选条件：应用R软件的在线程辑包，对各交集基因上述核心蛋白筛选参数数值进行测算，各组数值中大于本组中位值的基因予以保留，运行R脚本，筛选核心蛋白，见表1，筛选流程见图4。

图3 大承气汤与急性肺损伤的PPI网络图Figure 3 PPInetwork diagram of Dachengqi Decoction and acute lung injury

图4 CytoNca核心蛋白基因筛选流程图Figure 4 Screening flowchart of CytoNca core protein genes

表1 核心蛋白拓扑分析Table 1 Topological analysis of core proteins

2.6 交集基因的GO功能富集分析基于R软件3.6.0对大承气汤治疗急性肺损伤的55个作用靶点进行GO功能富集分析。富集内容包括细胞成分（celluar component，CC）、生物学过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）。富集条件为P值=0.05且Q值=0.05。通过分析发现，富集到了1 957个GO条目，细胞成分83个，生物学过程1 714个，分子功能160个。选取各排名前10位的富集条目，并根据每个项目的P值、Q值及富集在其上的基因数目绘制条形图，见图5。横坐标表示靶点数，左边表示BP、CC、MF，颜色表示P值，P值越小颜色越偏向红色，P值越大则越偏向蓝色。

图5 大承气汤治疗急性肺损伤的GO功能富集分析Figure 5 GO function enrichment of Dachengqi Decoction in treating acute lung injury

2.7 交集基因的KEGG通路富集分析基于R语言对交集基因进行KEGG通路富集分析。分析结果可见，55个复方疾病交集基因共富集到了126条通路（P＜0.05）。选取排名前20位的富集通路，根据每个通路的P值、Q值及富集在其上的基因数目绘制气泡图，见图6。横坐标表示富集到基因的数量，左边表示通路名称，颜色表示P值，P值越小颜色越偏向红色，P值越大则越偏向蓝色。主要涉及到P53信号通路。

图6 大承气汤与急性肺损伤交集基因KEGG通路富集图Figure 6 KEGG pathway enrichment of Dachengqi Decoction in treating acute lung injury

2.8 木犀草素、芦荟大黄素、柚皮素能降低LPS诱导的RAW264.7细胞中TNF-α、IL-6细胞因子水平MTT的数据结果表明，相较于正常对照组（Ctrl，药物浓度为0μmol∕L），浓度小于100μmol∕L的柚皮素组和芦荟大黄素组以及浓度小于12.5μmol∕L的木犀草素组对RAW264.7细胞没有毒性，具体结果见图7。药效实验的结果表明，柚皮素和芦荟大黄素从10μmol∕L浓度，木犀草素从2μmol∕L浓度开始，具有一定抑制TNF-α、IL-6细胞因子分泌的能力，且细胞因子的分泌水平呈剂量依赖性地降低，具体结果见图8。

图7 木犀草素、芦荟大黄素、柚皮素对RAW264.7细胞活性的影响Figure 7 Effects of luteolin，aloe-emodin and naringenin on RAW264.7 cell activity

图8 木犀草素、芦荟大黄素、柚皮素对RAW264.7细胞TNF-α和IL-6分泌的影响Figure 8 Effects of luteolin，aloe-emodin and naringin on secretion of TNF-αand IL-6 in RAW264.7 cells

2.9 木犀草素、芦荟大黄素、柚皮素降低LPS诱导的RAW264.7细胞中P53蛋白表达根据网络药理学预测结果，TP53基因在构建的成分-靶点-通路网络中，度值较大且控制着P53蛋白的表达。因此，本研究检测P53蛋白表达，对网络药理学预测靶点进行验证。Western Blot实验结果显示，与模型组比较，木犀草素、芦荟大黄素、柚皮素的干预能显著降低P53蛋白的表达，且与给药剂量呈现一定的量-效关系，具体结果见图9。

3 讨论

本研究基于网络药理学的方法探讨大承气汤治疗急性肺损伤的作用机制。根据OB和DL参数，共筛选出大承气汤化学成分27个，预测靶点经合并去重收集82个。构建有效成分-靶点网络图，结果表明，木犀草素（MOL000006 luteolin）、芦荟大黄素（MOL000471 aloe-emodin）、柚皮素（MOL004328 naringenin）等是其主要的化学成分。既往的药理学研究表明，木犀草素抗炎作用较强，能抑制IL-6、TNF-α等炎症细胞因子的表达，并且能够提高IL-10的表达水平来调控炎症反应[11]。周晓玲[12]研究发现，芦荟大黄素具有体外抗炎作用，能够以剂量依赖的方式降低LPS刺激的RAW264.7细胞中NO、TNF-a、IL-1β的释放。柚皮素具有较强的抗炎及抗氧化作用，薛传优等[13]研究发现，柚皮素可以降低IL-1β、IL-6和TNF-α基因的表达水平，改善脂多糖诱导的H9c2心肌细胞的炎症反应和细胞凋亡。

经过对55个交集基因蛋白进行核心蛋白筛选，结果显示TP53、JUN、MYC等是大承气汤治疗急性肺损伤起到重要作用的核心蛋白。Laurent等[14]发现TP53表达细胞的比例与炎症强度相关。SONG等[15]研究发现，c-Jun能够激活NLRP3炎症小体，促进其磷酸化，介导炎症反应。黄杰中等[16]研究发现，c-Myc与凋亡抑制因子呈正相关，表明其可以显著地抑制细胞凋亡。急性肺损伤的发病往往继发于肺部疾患的炎症反应，伴随着肺部毛细血管的损伤，引起细胞凋亡。可以看出TP53、JUN、MYC均与急性肺损伤的发生发展具有一定的相关性。

交集基因KEGG通路富集分析显示，其通路主要为P53信号通路。Wu等[17]的研究表明，通过抑制P53相关信号通路可以减轻类风湿关节炎炎症反应。炎症信号通路NF-κB蛋白表达水平亦可以影响凋亡因子P53的表达[18]。P53被认为是NF-κB调控的细胞凋亡因子，可以直接或间接影响参与细胞呼吸的多种酶的表达，并通过增加氧化磷酸化促进活性氧的产生[19]。也有研究认为，P53是调控细胞应答多种胞外信号的重要转录因子，可以增加促炎因子的产生[20]。

本研究通过细胞实验证实，木犀草素、芦荟大黄素、柚皮素均具有减少巨噬细胞炎症细胞因子TNF-α、IL-6释放的作用。Western Blot结果显示，3种活性成分均可剂量依赖性地降低P53蛋白的表达，对机体的炎症反应具有一定的抑制作用。

综上所述，本研究将网络药理学和生物信息学相结合，从网络层面系统地分析预测了大承气汤治疗急性肺损伤的化合物-靶点-通路作用机制，使用细胞实验和分子生物学方法验证了其药效与分子机制，这与中医的整体观念和辨证论治的理念相符合，为今后的相关研究和实验设计提供了参考和新思路。