瞬时热胁迫对秋季3种植物叶片光系统Ⅱ活性和色素含量的影响*

宋佳宝，刘煜光，周晓慧，赵丹，史宝胜

(河北农业大学 园林与旅游学院，河北 保定 071000)

光系统活性是植物生长过程中的一项敏感指标，叶绿素荧光参数能够反映植物叶片的光合效应以及热耗散等情况，进而有效评估逆境对光合作用损伤的相关机制[1]。热胁迫是一项重要的环境胁迫因素，发生在整个光合机构，阻碍线性电子及环式电子传递，导致植物光系统Ⅱ活性衰减，被不可逆损坏[2-3]。花色素苷是彩叶植物呈色的主要物质基础，已有研究证明花色素苷能够减弱过量ROS(活性氧自由基)的产生，保护处于逆境中植物的光合机构[4]。

日本晚樱(Cerasusserrulata)、日本樱花(C.yedo-ensis)为蔷薇科(Rosaceae)樱属(CerasusMill.)植物，紫叶矮樱(Prunus×cistena)为蔷薇科李属(PrunusL.)植物，树形优美，花开绚丽，芳香四溢，在城乡绿化美化、山地边坡治理中应用广泛，具有极高的生态、观赏和经济价值。目前，对于3种植物的研究主要集中在栽培繁殖技术[5]、生物学习性[6]、遗传关系[7]等方面。前人对3种植物的耐旱性[8-9]、抗污染物能力[10]等已经开展了丰富的研究，但主要集中在生化指标的测定方面，叶绿素荧光参数和光合特性对热胁迫的响应规律未见报导。因此，本研究以日本晚樱、日本樱花及富含花色素苷的紫叶矮樱为研究材料，采用人工控制热胁迫温度和时间，探讨热胁迫下3种植物叶片荧光特性和色素含量及其他生理指标的变化情况和相关性，旨在揭示热胁迫下其植物叶片光合响应机制及花色素苷对热胁迫伤害的协调保护机制，为耐热优质品种选育提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1 试验区概况

试验设在河北省保定市河北农业大学试验基地位(38°48′26.13″N、115°24′58.30″E)，属暖温带亚湿润气候，年平均气温12.7 ℃，年均降水量575.4 mm，年日照时数为2 560 h，年平均蒸发量1 760 mm，无霜期200 d，土壤类型为壤土，pH值7.6。

1.2 试验材料

试验于2020年9月底进行。供试材料为7～8 a生生长良好、长势一致的日本晚樱、紫叶矮樱、日本樱花，每种植物选取3株植株，每株间距3 m。所选植株四周无高大乔木和灌木遮阴，土壤气候条件一致。每植株采摘向阳主枝顶端起第4～8叶序叶片，取样叶片须完全展开，且无病虫害。采摘后，迅速置于湿毛巾中带回实验室。

1.3 试验设计

将采摘的3种植物的叶片置于内铺湿润滤纸的封口聚乙烯薄膜袋中，利用恒温水浴锅在完全避光条件下进行加热。测量温度为(25±0.2)、(30±0.2)、(33±0.2)、(36±0.2)、(39±0.2)、(42±0.2)、(45±0.2)、(48±0.2)、(51±0.2)℃，将温度计置于水中，使玻璃泡与叶片浸没于同一高度，确保温度的准确性。处理时间为5、25、45 min。

1.4 指标测定

1.4.1 叶绿素荧光参数的测定

将不同处理下的叶片用叶夹进行暗适应30 min后，采用FluorPen手持式叶绿素荧光仪(PSI，捷克)测定叶片快相叶绿素荧光诱导曲线(OJIP)，测定时下铺湿润滤纸，尽可能减少叶片水分流失对叶片测定参数带来的影响。每处理选取5个叶片的相应位置打取叶圆片作为5次重复，记录叶绿素荧光参数(表1)。

表1 叶绿素荧光参数及含义

1.4.2 叶绿素含量的测定

热胁迫处理后，每个处理每个重复均选取适量叶片，迅速擦净、去主脉，然后剪碎混匀。每处理称取0.1g叶片，3次重复。用95%乙醇作浸提液，置于暗处24h提取色素，用Thermo10S分光光度计(Cole-Parmer，美国)分别测定665、649、470nm处吸光值，用Arnon法修正公式计算叶绿素a(mg/g)、叶绿素b(mg/g)的含量[11]。

1.4.3 花色素苷含量的测定

花色素苷含量的测定按照Pirie等[12]的方法。称取适量叶片，用体积比1%盐酸甲醇溶液浸提，提取液分别于600、530、325、280nm处测定吸收值，以OD530～600 nm=0.1作1个单位，以U表示。

1.4.4 叶色的测定

采用全自动色彩色差计CR-400(柯尼卡美能达，日本)每个处理重复测定3次。测定指标包括L*、a*、b*，其中L*表示光泽明亮度；a*值表示色泽红绿程度；b*的正值表示黄色程度。

1.5 数据处理方法

运用Excel 2010和SPSS 26.0软件对测定数据进行作图及分析，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 瞬时热胁迫对叶绿素荧光参数的影响

2.1.1 对初始荧光(Fo)、最大荧光(Fm)的影响

与25 ℃对照相比，5 min热胁迫下紫叶矮樱Fo值随胁迫温度的升高而不断增加，51 ℃胁迫下的Fo值与CK差异显著(P<0.05)(图1A)；日本晚樱、日本樱花分别在48 ℃、51 ℃时差异达到显著水平(图1B、图1C)。当胁迫时间延长至25和45 min，紫叶矮樱、日本晚樱、日本樱花Fo值开始显著增加的温度分别为48 、45 和45 ℃，与5 min热胁迫处理相比均降低3 ℃。本试验中，热胁迫提高了紫叶矮樱、日本晚樱叶片的Fo值，表明其叶片PS Ⅱ反应中心遭到破坏，且破坏程度随胁迫时间延长和胁迫温度升高而增加。

图1 不同热胁迫处理3种植物Fo值的变化

随着温度的升高，紫叶矮樱、日本晚樱Fm值表现出先升后降的“单峰”变化趋势(图2A、2B)：与对照相比，紫叶矮樱Fm值在36 ℃达到峰值，随后又逐渐下降，最终降低至较低水平；日本晚樱Fm值在33 ℃左右达到峰值，之后不断降低，至42 ℃以上迅速降低。日本樱花Fm值在热胁迫下的变化则呈“上升(30 ℃)-下降(36 ℃)-上升(42 ℃)-下降(51 ℃)”的双峰型曲线(图2C)。Fm值可以反映PS Ⅱ电子传递情况。较高温度的热胁迫使3种试材Fm值显著减小，表明高温阻碍叶片中PS Ⅱ电子传递。

图2 不同热胁迫处理3种植物Fm值的变化

2.1.2 对最大光化学效率(Fv/Fm)的影响

热胁迫5 min处理下，随着温度的升高3种试材的Fv/Fm值呈缓慢下降趋势，至45 ℃以上Fv/Fm值迅速降低；胁迫时间延长至25 min和45 min，紫叶矮樱、日本晚樱的Fv/Fm值在温度升高至45 ℃以上就迅速降低，日本樱花在胁迫温度达到39 ℃以上时Fv/Fm值迅速降低，与5 min相比均有所提前(图3)。可见，45 ℃以上的瞬时热胁迫会显著降低3种试材PS Ⅱ原初光能化学转换率。

图3 不同热胁迫处理3种植物Fv/Fm的变化

2.1.3 对光系统Ⅱ反应中心活性参数的影响

由表2可知，5 min和25 min的较短时间胁迫下，与25 ℃对照相比，39～51 ℃的高温处理使3种植物的ABS/RC、TRO/RC、DIO/RC值显著升高，而在45 min较长时间的51 ℃高温胁迫下3种植物的ETO/RC值显著降低。25 min和45 min胁迫时间下ABS/RC、TRO/RC、DIO/RC、ETO/RC值发生显著变化时的温度(39～42 ℃)与5 min胁迫时间下(45～51 ℃)相比有所提前，幅度为3～6 ℃。最高热胁迫温度和最长热胁迫时间组合处理下，与对照相比，紫叶矮樱的ABS/RC、TRO/RC、DIO/RC值变幅最小，日本晚樱的ETO/RC值变幅最大。

表2 不同热胁迫处理3种植物PSⅡ反应中心活性参数的变化

2.1.4 对光系统Ⅱ能量分配比率的影响

由图4可知：随着热胁迫温度的升高，经45～51 ℃高温处理后的3种植物叶片φPo值显著下降、φDo值显著增加；φEo随着胁迫温度升高呈降低、升高再降低的趋势，胁迫程度最大，即51 ℃高温处理45 min时的值显著低于对照值，分别降低41.6%、77.0%、67.0%；随温度增加，日本晚樱ψo先降低后升高，日本樱花和紫叶矮樱ψo值先升高后降低，经51 ℃热胁迫后，3种植物ψo值均显著低于对照，降幅为19.8%、65.3%、32.5%。这表明，高温胁迫下，叶片光系统通过增加热耗散、调节PSⅡ能量分配比率以适应热胁迫。

图4 不同热胁迫处理3种植物叶片PSⅡ能量分配比率的变化

2.2 瞬时热胁迫对叶绿素含量的影响

随着热胁迫温度的升高，与25 ℃(对照)相比，5 min热胁迫时间处理下，紫叶矮樱的叶绿素含量呈现先缓慢上升再显著下降的趋势(图5A)，日本晚樱和日本樱花的叶绿素含量表现为下降趋势(图5B、图5C)，经33 ℃的热胁迫后，3种植物叶片叶绿素含量与对照相比均显著降低；胁迫时间延长20 min后，紫叶矮樱叶绿素含量先波动变化(25～36 ℃)再显著降低，日本晚樱和日本樱花的叶绿素含量逐渐降低；45 min的热胁迫下，日本晚樱和日本樱花经过30 ℃热胁迫后的叶绿素含量与对照相比显著降低(P<0.05)，紫叶矮樱发生这个过程的温度为33 ℃，与其他2种樱花相比温度有所升高。最高热胁迫温度和最长热胁迫时间组合处理下，紫叶矮樱、日本晚樱、日本樱花叶绿素含量较对照分别降低44.5%、70.3%、69.2%，试验结果表明：经高温热胁迫后紫叶矮樱叶片的叶绿素含量降低的幅度最小。

图5 不同热胁迫处理3种植物叶绿素含量的变化

热胁迫下，3种植物叶绿素a、叶绿素b含量逐渐减少，随着胁迫温度的升高和胁迫时间的增加，3种植物叶绿素a/b含量总体呈升高趋势，温度达到45～51 ℃，3种植物经历一个先降后增的过程(图6)。5 min热胁迫时间处理下，紫叶矮樱、日本晚樱、日本樱花叶绿素a/b值出现降低情况的温度为51 ℃、51 ℃、42 ℃；25 min处理下的拐点温度分别为51 ℃、45 ℃、45 ℃；45 min处理下则提前至48 ℃、45 ℃、42 ℃。51 ℃处理下3种植物叶绿素a/b分别增加23.2%、30.7%、45.5%，紫叶矮樱增幅最小。

图6 不同热胁迫处理3种植物叶绿素a含量/叶绿素b含量的变化

2.3 瞬时热胁迫对叶片花色素苷含量的影响

同一胁迫时间下，3种植物叶片花色素苷含量随温度的升高而减少；同一温度下，花色素苷含量随时间延长而减少(图7)。当胁迫程度达到最大，即胁迫温度为51 ℃、胁迫时间为45 min时，紫叶矮樱、日本晚樱、日本樱花花色素苷含量分别为对照的66.6%、17.3%、16.7%。这说明高温在一定程度上影响3种植物叶片中花色素苷的合成或分解，而紫叶矮樱的花色素苷热稳定性最高。

图7 不同热胁迫处理3种植物花色素苷含量的变化

2.4 瞬时热胁迫对3种植物叶色的影响

随热胁迫温度的升高和热胁迫时间的延长，3种植物叶片L*逐渐降低，a*值逐渐增加，b*值有所降低(表3)。当热胁迫程度达到最大(51 ℃、45 min组合处理)时，与对照相比，日本晚樱、紫叶矮樱、日本樱花L*值分别降低19.81%、10.06%、11.17%，a*值分别增加31.15%、25.57%、48.73%，b*值分别降低56.69%、3.08%、25.4%。表明高温能够降低3种植物叶片的亮度，提高叶片红绿比值，降低黄蓝比值，使呈色偏向红色。3种植物中，紫叶矮樱叶色参数的变化最小。

3 讨论

3.1 瞬时高温胁迫诱导植物光系统活性的降低

叶绿素荧光参数是在生理生化水平上了解热胁迫和热胁迫耐受性的重要指标。植物PS Ⅱ对逆境胁迫非常敏感，在植物正常生理条件下，其潜在的PS Ⅱ光化学效率Fv/Fm变化很小，而逆境条件下该参数则会明显降低[13]。已有研究结果表明，高温胁迫会导致植物叶片Fo增加，Fm、Fv/Fm显著下降[14]。本研究与上述结果一致。说明PS Ⅱ反应中心及放氧复合体OEC受高温影响失活，抑制QA向QB的电子传递，受体侧电子QA不断积累，PS Ⅱ稳定性降低，进而影响植物的光合功能[15-16]。此外发现，Fv/Fm在受到较低温度(25～45 ℃)的热胁迫和高温热胁迫(45 ℃以上)时下降程度不一，45 ℃以后显著下降，推测3种植物在受到45 ℃以下的较低温度胁迫时，能够通过调节补光天线系统的方式减少PS Ⅱ供给侧激发能的积累或利用其他方式来减少光系统伤害程度；在高温热胁迫逆境下，叶绿素稳定性遭到破坏，电子传递链受损，光化学效率降低以配合CO2同化能力的降低，PS Ⅱ受到破坏。日本樱花经过连续45 min的48 ℃的热胁迫后，φPo、Fv/Fm降为0，与油菜(BrassicanapusL.)经高温胁迫后的结果一致[17]，进一步说明重度高温胁迫致使叶片光系统Ⅱ发生不可逆损害。

表3 不同热胁迫处理下3种植物L*、a*、b*的变化

试验发现，3种植物在受短暂高温胁迫后比活性参数与初始值无显著差异，说明它们通过调节自身对光能的吸收、捕获、传递和耗散，最终获得较高的光能转换能力，PS Ⅱ活动能够正常进行[18]。ABS/RC、DIO/RC、TRO/RC值在最大热胁迫程度下迅速升至高水平，可能是因为长时间(45 min)的高温(51 ℃)处理致使3种植物因热耗散不足而导致光能过剩，使得PS Ⅱ产生光抑制，光合机构被不可逆的损坏。而φDo升高，说明3种植物叶片通过提高热耗散将过剩的光能散失，从而达到降低高温伤害的目的，这也是3种植物自我保护的体现。随高温胁迫时间的增加，叶片φEo下降，说明高温使QA传递受阻。当胁迫温度超过45 ℃，这3种植物的φEo阈值存在差异，紫叶矮樱明显更低，说明其电子传递能力更强，光合效率更高。

3.2 花色素苷对光系统具有保护作用

不同植物对热胁迫处理的生理反应明显不同。紫叶矮樱的Fo值及变幅、Fv/Fm的降幅最小，说明其耐热性较高，这可能与花色素苷的保护作用有关，即当植物叶片吸收光能出现过剩时，叶片中大量的花色素苷可以通过吸收和过滤蓝紫光，减轻叶片光抑制和光氧化伤害程度[19]。张会慧等研究证明，花色素苷能够改变丁香叶片吸收和利用光能的途径及耗散过剩光能的方式[20]。富含花色素苷的紫叶矮樱的ABS/RC、ETo/RC、TRo/RC和DIo/RC低于花色素苷含量较低的日本晚樱和日本樱花，由此推测：紫叶矮樱叶片因花色素苷的大量存在而减轻吸收的光能，对缓解高温对PS Ⅱ反应中心的破坏具有积极作用。

高等植物光系统Ⅱ的补光天线(LHCⅡ b)是捕光色素蛋白复合物，代表叶绿素b向叶绿素a的能量传递，高温使LHCⅡ b稳定性降低，叶绿素a/b增加[21-22]。本研究发现，紫叶矮樱叶绿素a/b的的变幅最小，可能是因为其叶片中存在大量的花色素苷，能够减少高温对LHCⅡ的影响，进而使叶绿素a/b增加速度减缓[23]。这也印证了紫叶矮樱耐热性优于日本晚樱和日本樱花的说法。

总的来说，紫叶矮樱叶片中较高含量的花色素苷可改变其对光能的吸收，从而具有有效缓解热胁迫造成的光抑制、减轻热胁迫对叶片光合机构尤其是PS Ⅱ反应中心的伤害、降低对细胞中叶绿素的破坏程度、保护光合机构的作用，这可能是紫叶矮樱对高温热胁迫具有较强抗性的原因之一。