啮齿类动物局灶性脑缺血模型研究进展

沈亚亭 白秀 王明威 张旭龙 谢西梅

脑卒中是一组急性脑循环障碍所致的局限或全面性脑功能缺损综合征，常由脑血管阻塞或出血所诱发。其中，缺血性卒中约占总数的87%，且又以局灶性脑缺血更为多见[1,2]。因此制备更有效可靠的局灶性脑缺血动物模型对研究人类缺血性卒中发生、发展的病理生理学机制及其防治意义重大。在对临床卒中的异质性进行建模时，存在多种不同的局灶性脑缺血模型，每种模型都有其优势和局限性。因鼠类脑血管结构和生理学特征与人类相似，是实验中最常选用的动物。故本文将目前最常用的啮齿类动物局灶性脑缺血模型及其改良方法加以介绍，并讨论各种模型的优缺点。

1 线栓法

线栓法是一种近端大血管闭塞的模型，类似于卒中患者的大脑中动脉M1段(即从颈内动脉分叉延伸至侧裂)闭塞[3]。Koizum等[4]最早对该模型进行研究和描述，不久Longa等[5]对其加以改进后更为经典。具体制备方法如下：首先将大鼠麻醉后仰卧位固定在手术台上，颈部常规备皮消毒，然后沿颈部正中做一2～3 cm长的切口，注意避免刺激气管和迷走神经，分离一侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，并电凝切断颈外动脉的分支甲状腺上动脉和枕动脉。线栓的插入位置，有2种方式：(1)自颈外动脉插入线栓：先用动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉近心端，用缝合线扎紧颈外动脉远心端，而在近心端打个松散的活结，并在两缝线间剪开一个微小切口，选择合适的线栓由此进入，稍系紧颈外动脉近心端的结，以稳定线栓。松开颈内动脉上的动脉夹，线栓沿此前进，直至有轻微阻力即到大脑中动脉起始端为止，此时再一次将颈外动脉近心端的结系紧，松开颈总动脉的动脉夹。 (2)自颈总动脉插入线栓：结扎颈总动脉和颈外动脉近心端，动脉夹夹闭颈总动脉远心端，在动脉夹近端置一打好松结的缝线备用，再在缝线近端剪一小口将线栓送入颈总动脉过缝线后，系紧缝线以保证线栓能通过，又不见动脉切口渗血，松开动脉夹。若制备永久性缺血模型，则直接剪短血管外的线栓，消毒，缝合颈部切口即可；若要研究缺血性再灌注损伤，则需在特定的阻塞时间后拔栓。经颈外动脉插入的线栓拔栓时，先将颈总动脉近心端用动脉夹夹闭，再解开颈外动脉近心端的缝线将线栓拔出，之后再将缝线扎紧，松开动脉夹，消毒缝合皮肤，放回笼中饲养；经颈总动脉插入的线栓拔栓时，动脉夹夹闭颈总动脉近心端，不必完全退出线栓，以免动脉切口出血，剪去多余线栓，消毒，缝合皮肤，放回笼中饲养，完成造模。

研究表明用来诱导大脑中动脉闭塞的线栓的选择、处理和再灌注时间与梗死体积、可重复性及死亡率都有很好的相关性[6]。实验动物麻醉常选用10%水合氯醛(350 mg/kg或0.35 ml/100 g)腹腔内注射，且线栓的长度和粗细与实验大鼠的体重呈正相关[7]。大多实验常选用体重为250～300 g的雄性大鼠，这需使用直径为0.22～0.26 mm的且栓头涂覆有硅酮、石蜡等的鱼线效果最好，线栓的插入深度一般是(18.5±0.5) mm[8-10]。此外，也有Hamberg等[11]开发出球囊导管法被认为是线栓法的改进术式，通过从股动脉放置导丝引导球囊导管经过升主动脉、颈总动脉，然后从颈内动脉入颅，经由改变球囊的大小以实现血流的中断与再通。又有Jungreis等[12]用导丝永久性阻断大脑中动脉并用球囊可逆性阻断颈内动脉，形成脑缺血模型。这种技术，损伤小，重复性好，能够精确控制缺血灌注时间，但是对技术手法的要求较高，且要在影像学的指引下进行，不如线栓法使用广泛。

临床研究中还发现，人类缺血性中风常常不是血管的完全闭塞，且大多数患者在中风后的48 h内会发生由于血栓连续消退而引起的部分自发性灌注，而在动物模型中去除线栓后会出现迅速的再灌注量激增，这与临床现象存在偏差[13]。此外，该模型也会发生一种在人类中很少见的现象，即大鼠大脑中动脉闭塞120 min或更久后会导致下丘脑自发性高热，这也成为了此模型的主要缺点[14,15]。

2 光栓法

光栓法即通过向动物血液注入光敏染料，然后使用特定光照射动物脑组织表面激活光敏诱导剂，发生光化学反应后释放活性氧自由基，导致血管内皮过氧化损伤以及血栓形成，从而造成荧光照射区域缺血性脑损伤[16]。这一模型最初由Watson等[17]于1985年首次介绍。首先将小鼠麻醉后，俯卧固定于立体定位仪上，剃除头顶部毛发并消毒，矢正中线纵向剪开头顶皮肤剥离周围结缔组织，暴露颅骨以bregma点为基准原点，于矢状缝左侧2.0 mm，冠状缝后2.0 mm处为卒中模型窗口，即大脑中动脉远端额支和顶支的Y形交界处，在解剖镜下用高速颅骨钻打磨暴露的颅骨至50 μm左右厚度，保持硬膜完整，直到皮层血管清晰可见。然后通常在尾静脉注射孟加拉玫瑰红染料溶液，随后用定波冷光源 (560 nm)照射卒中窗口，形成实验动物缺血性脑损伤模型。

有学者对该模型进行了不同的改良，如已经开发出使用圆形激光束及调整照明参数等方式照射卒中窗口，模仿人类脑缺血后所产生的半影带[18]；也有以单个血管为靶点进行造模，并尽量减少对靶血管周围组织的不必要的光激活损伤，从而极大限度地提高了动物模型与人类中风的相关性[19]；另有研究者利用立体定向植入光学纤维束以诱导大鼠纹状体或内囊的梗死[20,21]；此外，Lu等[22,23]在自由活动的大鼠和小鼠中成功诱发了光血栓性中风，由此可以在没有麻醉干扰的情况下，实时分析急性中风的相关参数，以及研究运动皮层缺血和运动缺陷之间的联系；Sunil等[24]则充分结合了之前技术的优点，创建了在清醒小鼠中诱导靶向单个血管的光血栓模型，并通过激光散斑对比成像(LSCI)和行为评估，证实了该方法能够形成可靠的功能缺陷性卒中，可以用于研究卒中后的恢复机制或测试潜在疗法对恢复过程的影响。

光栓法模型是一种高度可重复的缺血模型，易于操作，侵入性小，稳定性好，它可产生精确的梗死位置和大小，且具有死亡率低的优点。其梗死灶大小与光敏诱导剂种类、剂量及特定光源的强度、时长相关。目前广泛应用于缺血后神经行为评估，并且可能对研究自由基清除机制的干预特别有用。该模型诱导的中风，细胞毒性和血管源性的水肿几乎同时出现，这可能与缺血性损伤和内皮损伤的同时发生有关，而人类卒中的主要特征是细胞毒性水肿，且半影带是人卒中后保护和治疗的主要目标，这便又引出了该模型的另一不足，即缺乏侧支血流和几乎没有半影带。

3 开颅手术模型

Robinson等[25]首次制备并描述了该模型，而后Tamura等[26]对实验动物行开颅手术后，通过电凝闭塞大脑中动脉近端导致皮质和纹状体梗死的模型也较为常用。具体操作：将大鼠麻醉后侧卧于手术台上，剪去一侧外耳道至眼外眦之间的毛发并消毒，在这两点连线的中点作一长约2 cm的切口。用止血钳将切口充分暴露，分离肌肉，切断颞肌，暴露颅骨，并将颧弓离断除去，暴露卵圆窗，用骨钻在卵圆窗前3 mm下1 mm处钻孔，在显微镜下可透过硬脑膜看见大脑中动脉，垂直于嗅束上行。挑破硬脑膜，分离大脑中动脉周围的蛛网膜，暴露大脑中动脉。然后将大脑中动脉挑起后用电凝器凝闭，电凝位置在其分支豆纹动脉之前或靠近颈内动脉处，从而制成脑缺血模型。

除电凝阻断外，有学者还通过直接离断和结扎制成永久性缺血模型，或者是通过微动脉夹子、微小金属钩等将大脑中动脉从脑表面抬起直至血流中断，制成暂时性缺血模型[27]。此外，也有研究者通过相对简单的开颅结扎术闭塞位于浅表大脑皮层的大脑中动脉远端主干制备模型[28]。张颖等[29]对此模型进一步改进，即先通过颅骨钻孔电凝大脑中动脉，再中断双侧颈总动脉血流15 min以建立模型，这会减少侧支血流，从而巩固缺血性损伤，可实现皮质区清晰梗死灶。

该模型的主要特点是能够在可视化下操作，可直接控制血管闭塞的部位和程度，如果在大脑中动脉近端进行闭塞，将导致影响皮质和纹状体的联合梗死，而远端大脑中动脉的闭塞，结合两个颈总动脉的短暂闭塞，只会导致皮质损伤[30]。此模型具有成功率高，可重复性好，梗死面积变异性较小，且梗死灶周围有清晰的半影带的优点。因此，被广泛用于评估急性缺血后的神经修复及促进神经可塑性等方面的研究。

4 栓塞中风模型

栓塞性中风模型可分为微球或大球所诱发的栓塞和血栓栓塞性模型两大类。所有种类的栓塞模型都是Kudo等[31]描述的大鼠血栓栓塞后脑卒中模型的变体。其中微球/大球诱发的栓塞中风模型，通常使用的球体材质有硅树脂，胶原蛋白，二氧化钛和葡聚糖等，微球直径一般是20～50 μm，其诱导过程包括使用微导管经颈外动脉将微球注入颈内动脉或大脑中动脉，并随血液流动进入脑循环，进而引起多个血管的微栓塞，最终导致多灶性和异质性梗塞。大球模型常选用直径300～400 μm的球体，与微球操作基本相似。

血栓栓塞性中风模型最常见的是经由颈外动脉向颈内动脉和大脑中动脉注射基于自体血液自发形成的或由凝血酶，纤维蛋白原诱导的具有特定直径和长度的血块。具体操作如下：大鼠麻醉后仰卧于手术台上，经颈部正中切口暴露分离一侧颈总动脉，颈外动脉及其甲状腺上动脉、枕动脉分支，颈内动脉及其分支翼腭动脉。永久性电凝甲状腺上动脉、颈外动脉远端、枕动脉，临时夹闭其他动脉。将PE导管置入颈外动脉腔内，颈内动脉上的夹子松开后，血栓以短暂的爆发力快速注入血管内。然后拔出导管，松开颈总动脉和翼腭动脉上的夹子，缝合皮肤切口。此外，还有通过显微注射凝血酶来制备小鼠原位血栓栓塞性中风模型，即通过开颅手术，暴露大脑中动脉远端分支，并用微管将纯化的凝血酶注射到血管腔内，注射部位立即形成血纤维蛋白凝块，从而导致该区域灌注迅速减少，形成梗死体积稳定、可重复性高，且死亡率低的卒中模型[32]。也有学者是将氯化铁(FeCl3)诱导剂浸泡过的滤纸条直接贴附于覆盖大脑中动脉主干的硬脑膜上或将其直接贴附于颈总动脉然后在机械刺激下促进氯化铁触发的血栓栓塞到大脑中动脉[33,34]。

有研究表明，在人类缺血性中风中，约50%的病例是由于大血管动脉粥样硬化和动脉粥样硬化斑块破裂所致[35]，且血栓栓塞性中风动物模型病理学进程与人类相似，包括细胞毒性水肿，随后的血管源性水肿，血脑屏障的破坏，半暗带的出现及炎性反应等，因此血栓栓塞模型与临床情况更具相似性[36]。其中血块的大小、成分、位置对于精确地在大脑中动脉附近形成栓塞至关重要，只有当血块滞留在靠近大脑中动脉分叉处的颅内颈内动脉段和大脑中动脉段时，才能在大脑中动脉区域实现可复制的缺血性损害。此外，实验制备的血块成分主要由纤维蛋白组成与人类有很大不同，且梗死的位置和梗死体积变异性较大，故根据其特性该模型常用于评估溶栓治疗(rt-PA)的效果或测试新的溶栓剂。而由FeCl3化学诱导所制模型，则特别适用于使用激光散斑流量计或双光子显微镜对大脑皮质进行活体实时研究。

5 内皮素-1模型

该模型是基于内皮素-1的应用，它是持久有效的血管收缩肽，根据其注射的浓度不同，可以改变缺血的严重程度和持续时间以及所引起梗塞面积的不同。通常内皮素-1给药后，脑血流量迅速降低70%～90%，随着注射时间的延长，内皮素-1的浓度随之降低，血流便会逐渐恢复，因此该模型常用来模拟短暂性脑缺血的情况[37]。其操作是将内皮素-1直接应用于暴露的大脑中动脉、脑表面或立体定向注射到脑实质通过其收缩血管的特性来诱发梗塞。脑内注射内皮素-1会造成外侧纹状体和皮质联合梗死，而硬膜下靶血管给药可导致仅局部皮质缺血性损伤。此外，也有学者是将引导套管预先植入所要梗塞的部位，从而可将内皮素直接注入到有意识的动物体内，这便能够消除麻醉所产生的不良影响，并在ET-1诱导卒中的同时动态观察其引起的组织学损伤和神经功能缺损的程度，适用于评价神经保护药物的疗效[38,39]。

内皮素-1模型较以往手术方法机械损伤轻微，死亡率较低，且可在浅表或深部脑区直接诱发缺血；而缺点则是应用此法诱导的缺血发展缓慢，仅伴有轻微的水肿，且组织再灌注会根据离给药部位的远近而产生不可控的变化，因此梗塞体积变异性高[40]，从而无法准确模拟人类大多数中风，可能仅对于模拟腔隙性中风和长期恢复机制的研究更有用。此外，有研究表明内皮素-1受体和内皮素-1转化酶也在神经元和星形胶质细胞表达，并且内皮素-1的应用可以诱导星形胶质细胞的增殖、促进轴突的萌动，这可能会对脑卒中后恢复机制的研究产生干扰[41-43]。

6 自发性卒中模型

高血压是中风初期和复发的主要危险因素，其在脑卒中患者中的破坏性影响促使我们有必要将动脉性高血压动物模型纳入脑卒中的研究中。中风研究中代表性的高血压动物模型有中风易发性自发性高血压大鼠(SHRSP)和中风易发性肾血管性高血压大鼠(RHRSP)，两者都有较高的自发性中风发生率。1963年冈本和青木开发的中风易发性自发性高血压大鼠(spSHR)，类似于人类的原发性高血压[44,45]。spSHR在出生6周后通过高盐饮食形成高血压，12周后迅速加重为恶性高血压(>240 mm Hg)，从而可导致在纹状体和皮层下白质中出现小的皮层下梗死，梗死灶的形成是由高血压性小血管疾病引起的，伴随小动脉壁增厚、纤维蛋白样坏死和血管周围间隙增大，与人类病理类似，可以很好地模拟人类腔隙性中风[46-48]。此外，中风易发肾血管性高血压大鼠(RHRSP)于1998年引进，是一种独立于遗传缺陷的获得性高血压动物模型，属于继发性高血压[49,50]。在这个模型中，当大鼠年轻时(80～100 g)，暴露双肾动脉的根部并用直径0.3 mm的环状夹子夹紧，血压在双侧肾动脉收缩后的第一周开始升高，并在第3个月左右持续升高至180～220 mm Hg，约6个月后逐渐达到并稳定在200～240 mm Hg。由于脑动脉的形态和生理变化与高血压患者相似，大鼠的自发性脑卒中发生率高于60%。但由于自然卒中的发生时间不确定，且基于脑卒中发病率随季节变化而波动的事实，Liu等[51]首次提出了利用环境控制室，在RHRSP中产生可重复的快速降温来诱发自发性脑卒中，该方法的优点是建立了与人类气象条件相关的自然卒中动物模型，使研究者不必等待很长时间。

该动物模型具有以下优点:脑血管病理生理学与人类高血压高度相似、造模技术简单；但也存在造模周期长，卒中发生类型不确定的局限。因此也可使用RHRSP联合以上各种造模方法制备脑缺血模型，以更好地模拟人类高血压动脉硬化脑卒中模型。

7 不足与展望

造模时，所选动物的年龄、性别和动物品系等都会对卒中模型性能和结果产生影响，有研究表明年龄是脑卒中动物模型临床前研究的关键因素[52]。缺血性卒中主要发生在老年人，但是目前大多数实验性中风的活体动物模型几乎普遍选用年轻的成年啮齿动物来完成。众所周知，老年动物卒中后通常神经功能损害更严重，且恢复能力远低于年轻动物,因此使用年轻动物造模与临床实际存在偏差[53]。性别可能是影响中风结局的另一个因素。许多研究也表明，雌性激素在年轻成年动物中具有神经保护作用,这可能会对卒中后神经保护机制的研究产生干扰[54]。此外，即使采用相同的缺血模型制备方法，不同的菌种和同一菌种的不同菌株也可能产生不同的结果。例如，Sugimori等[55]发现，使用氪(Kr)激光诱导光血栓闭塞MCA,BALB小鼠和比C57BL/6小鼠相比，所产生的梗死灶面积更大且可重复性更高。因此，根据研究目的选择合适的动物品系是很重要的。除上述因素外，考虑到卒中患者往往伴有一种或多种并发症,实验中可应用高血压品系或糖尿病品系等的实验动物以模拟人类病情的复杂性。另外，在动物建模过程中,注意对多种生理性变量的优化和把控,如血流量[56]、体温[57]、麻醉[58]等，也可增进动物模型与人类临床实际的相关性。

人类脑卒中的相关认识研究大都是通过动物实验获得的，且基于动物模型的研究也开发测试了许多新的药物和疗法。但是由于脑血管疾病的复杂性和患者自身状况的多样性，试验过程中发现的许多神经保护策略未能在人类身上成功转化，想要建立通用型动物模型显然也是不切实际的。因此在不断规范和量化实验模型相关操作、改进技术的同时，研究者也要根据具体情况做综合立体化的考量，选择合适的造模方法，以便从动物组织中获取更接近人类脑卒中疾病变化真实情况的结果，从而提高实验中有效疗法转化为临床治疗的潜力。