戊二醛癸甲溴铵对链球菌的消毒效果评价

王利平，谭东鹤，刘新月，赵会敏，李 鹏*

（1．新乡学院生命科学与基础医学学院，河南新乡453003；2．浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州310018）

近年来大量动物疫病的暴发，养殖业遭受巨大的经济损失，养殖者对疫病预防愈发重视，而消毒工作是疾病预防过程中重要环节之一。畜禽经常与人类生活环境亲密接触，为感染疾病创造了条件，养殖者开始采用一些物理、化学、生物类消毒方法进行控制[1]。消毒是为了杀灭物体外表附着的细菌，防止感染畜禽，也可以更好地控制畜禽舍内空气污染情况[2]。目前市场上的消毒剂大多均是通过将病原媒介上的微生物彻底杀灭，以达到对各种病菌病毒的有效控制，从而实现无害化要求[3]。

我国最早使用戊二醛癸甲溴铵溶液作为新一类消毒剂，是因为其继承了醛类消毒剂和季铵盐类消毒剂的优点，能够达到双重杀菌消毒效果[4]。戊二醛癸甲溴铵复合消毒剂是市场上比较常用的消毒剂，主要应用于猪舍环境杀菌、消毒池消毒。焦西斌等[5]针对戊二醛季铵盐复合制剂应用于临床消毒进行了研究，但是少有关于戊二醛癸甲溴铵溶液消毒剂用在实验室内的消毒报道。戊二醛癸甲溴铵溶液低毒性，受有机物、温度以及金属腐蚀性的影响较小，在医疗应用中能延长医疗器械的使用时间，从而维持设备使用安全[6]。我国出现人被传染禽流感、猪链球菌病等疫病，不仅影响农业经济，也威胁到人类的健康。随着我国的畜牧养殖业的发展，养殖场周围的生活环境污染越来越多地受到重视[7]。为研究配比不同浓度条件下的戊二醛癸甲溴铵溶液对链球菌的消毒效果，试验采用猪链球菌为试验指示菌，以抑菌圈试验和悬液定量杀菌试验为判断标准，以期为畜牧业中开展消毒防疫工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验指示菌

链球菌由新乡学院生物技术实验室提供。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂

戊二醛癸甲溴铵溶液，由新乡学院生物技术实验室保存；吐温80、甘氨酸、硫代硫酸钠、卵磷脂，均购自北京索莱宝科技有限公司；BHI液体培养基、BHI固体培养基，均购自青岛海博生物技术有限公司。

1.2.2 仪器

DGX-9143B-1干烤箱、DPX-9082B-1恒温培养箱、DL-CJ-1N超净工作台、BXM-30R立式压力、蒸汽灭菌器、37℃恒温摇床、ESJ200-4电子天平、BCD-172JA冰箱。

1.3 试验方法

1.3.1 消毒剂的制备

在无菌、常温条件下，取成品戊二醛癸甲溴铵溶液与无菌硬水比例为1∶10活化30 min，作为稀释后待测液备用。根据产品含量说明，将消毒剂戊二醛癸甲溴铵分别稀释至9.00、6.00、4.50、3.00、2.75和2.25 mg/L。

1.3.2 菌悬液的制备

取猪链球菌保存菌液按照1∶100的比例与BHI液体培养基混合，37℃、160 r/min条件下摇床培养12~14 h制成菌悬液备用。培养后的菌液按照1∶10的比例，37℃、160 r/min、3 h条件下进行第2次摇菌，即对数期菌液的制备[8]。根据《消毒技术规范》PBS灭菌处理后的菌液，无菌环境下，制备浓度为5×106~5×107CFU/mL的菌悬液。

1.3.3 抑菌圈试验

准备LB固体平板，取100µL菌悬液涂布均匀后，使用200 µL移液枪枪头进行打孔，孔径约为6 mm；每孔加入50µL不同浓度无菌硬水稀释的消毒剂[9]，并以无菌硬水作为阴性对照；置于37℃恒温培养箱内，培养14~16 h，对出现抑菌圈的平板进行测量。

1.3.4 中和剂筛选试验

根据消毒剂技术规范，筛选的中和剂为3%吐温80+1%甘氨酸，根据上述抑菌试验结果选择消毒剂浓度为3 mg/L。

第1组：吸取消毒剂4.5 mL于试管内，置（20±1）℃水浴中5 min，吸加0.5 mL菌悬液，混匀，作用至预定时间，吸取样液0.5 mL于含有4.5 mL稀释液试管中混匀。吸取最终样液1.0 mL，接种于平皿中，做活菌培养计数。

第2组：吸取消毒剂4.5 mL于试管内，置（20±1）℃水浴中5 min，加0.5 mL菌悬液混匀，作用10 min，吸样液0.5 mL加含4.5 mL中和剂溶液管中混匀，作用10 min。吸取最终样液1.0 mL，接种于平皿中，做活菌培养计数。若平板生长菌落数均超过300个，应以稀释液对上述最终样液作适宜稀释后，再次进行活菌培养计数。

第3组：吸取中和剂4.5 mL于试管内，置（20±1）℃水浴中5 min，再吸加0.5 mL菌悬液混匀，作用10 min。吸取最终样液0.5 mL，用中和剂做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取1.0 mL，分别接种于平皿中，37℃恒温培养14~16 h后，做活菌培养计数。

第4组：吸取中和产物溶液（以1份消毒剂加9份中和剂，作用10 min配制而成）4.5 mL于试管内，置（20±1）℃水浴中5 min，再吸加0.5 mL菌悬液混匀。作用10 min，吸取最终样液0.5 mL，使用中和产物溶液做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取1.0 mL，分别接种于平皿中，37℃恒温培养14~16 h后，做活菌培养计数。

第5组：吸取PBS 4.5 mL于试管内，置（20±1）℃水浴中5 min，再吸加0.5 mL菌悬液混匀。作用10 min，吸取最终样液0.5 mL用稀释液做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取1.0 mL，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。

第6组：分别吸取PBS与中和剂各1.0 mL于同一无菌小平皿内，倒入上述试验同批次的培养基15～20 mL培养观察。如出现细菌生长，可能提示试验材料或操作过程中有污染，应重新进行试验[12]。

1.3.5 悬液定量杀菌试验

取100µL菌悬液，注入900µL BHI培养液中，室温下160 r/min摇床进行培养3 h。把摇床后溶液用灭菌PBS进行10倍梯度稀释。使用无菌硬水将消毒剂配制至所需待测浓度，分别取100 µL菌悬液，加入900 µL浓度分别为2.25、2.57、3.00、3.60、4.50 mg/L的消毒剂中，振荡混合均匀，在常温条件下作用10 min，再取100 µL反应液与900µL中和剂混匀，再次振荡，最后取10µL点涂于相应营养平板上[13]。

2 结果与分析

2.1 抑菌圈试验结果（见表1、图1）

由表1和图1可知，在抑菌验条件下，戊二醛癸甲溴铵对猪链球菌无明显抑菌效果。

表1 抑菌圈试验Tab.1 Bacteriostatic circle experiment

2.2 中和剂鉴定试验结果（见表2、图2）

表2 中和剂鉴定试验Tab.2 Neutralizer Iidentification experiment

由表2可知，第1组和第2组无菌落生长；第3组、第4组和第5组有菌落生长，且数量均大于300；第6组无菌落生长，符合中和剂试验判定标准。可判定PBS稀释的1.5%吐温80+0.5%甘氨酸可以有效终止戊二醛癸甲溴铵对菌体的作用。

由图2可知，在戊二醛癸甲溴铵溶液消毒剂有效浓度为3.00、3.60、4.50µg/L的时候，常温下作用10 min后可完全对试验菌进行杀灭。戊二醛癸甲溴铵溶液消毒剂在一定浓度下可以有效杀灭猪链球菌。

3 讨论

畜禽业集约化养殖已成为当前养殖产业采用较多的一种养殖方式，但是这种养殖方式由于环境不卫生、饲养管理以及免疫程序不科学等情况的影响，导致细菌性疾病暴发。对细菌病毒传播抑制不当，会造成混合性感染和继发性感染。试验针对戊二醛癸甲溴铵溶液对病原微生物的消毒效果的分析，在制备试剂时，选择适当的比例保证了接下来的操作步骤的精确性[14]。从抑菌圈试验结果可知，戊二醛癸甲消毒剂在不同浓度时抑菌效果相同，均对猪链球菌无效；中和剂筛选试验中的第3组可判断中和剂是否对消毒剂的杀菌效果产生影响[15]。在试验过程中，节省人力、物力等成本，使结果有更明显的对比，并排除了平板间差异带来的影响。但试验的灵敏性相对较小，不利于对试验进行精确的分析[16]，试验结果有细小的偏差。

4 结论

研究可知，戊二醛癸甲溴铵溶液消毒剂在有效浓度为3.00、3.60、4.50µg/L，常温条件下作用10 min后完全杀灭试验指示菌。要准确分析、评价消毒剂的消毒效果，应了解每类消毒剂最适消毒浓度。本试验结果为更高效使用消毒剂，做好疾病防护提供了一定参考。