浓缩生长因子应用于再生性牙髓治疗作用的研究进展 *

黄贲亨，黄 彬

(湖北科技学院五官医学院，湖北 咸宁 437100)

与成熟恒牙不同，当年轻恒牙因龋坏、外伤等原因导致牙髓感染进而出现牙髓坏死时，较薄的根管壁和未闭合的根尖孔使治疗过程充满困难[1]。尽管目前主要治疗方法有根尖诱导成形术和根尖屏障术，但存在一些不足之处：一方面缺乏组织修复能力，无法促进根管内受损牙髓组织的再生；另一方面因牙根发育停滞而出现根管壁较薄和短根的情况，增加牙折的发生率，最终导致治疗失败[2]。再生性牙髓治疗(regenerative endodontic treatment，RET)是以组织工程学为基础，通过再生的牙髓样组织取代感染或坏死的牙髓组织，从而最大程度保留牙齿的活力使其继续发育[3]。越来越多的临床研究[4-6]证明了RET应用于牙髓坏死的年轻恒牙的优异性。牙髓再生与组织工程学中的3个主要组分密切相关：干细胞、支架及生长因子。浓缩生长因子(concentrated growth factors，CGF)作为最新一代的生物支架材料，其制备过程不需要添加其他试剂，是一个更简单的过程。CGF中产生的纤维蛋白网络与天然纤维蛋白网络非常相似，并且包含血小板和白细胞所产生的各种生长因子，是一种与生长因子良好结合的支架基质。此外，近年来大量研究[7-8]证明其拥有巨大的组织细胞再生潜力，对于细胞的增殖、分化和迁移均发挥良好效果。本文主要对CGF的主要成分、功能及其应用于再生性牙髓治疗的作用做一综述。

1 CGF的主要成分及功能

经过特定的变速离心程序后，血液样本呈现3层结构，CGF位于中间层。超微结构显示，CGF由大量细纤维蛋白和细纤维蛋白原构成，并呈现出多孔结构[9]。经组织染色观察，CGF上部没有细胞，而在下部聚集大量的白细胞、红细胞以及血小板，嵌入在三维纤维网络中[10]。另外CGF中存在大量CD34+细胞，其在血管生成和维持血管形态中的作用得到越来越多研究证据的支持[11-12]。生长因子是一类天然生物介质，可调节组织修复中重要的细胞活动，包括细胞增殖、分化、迁移和胞外基质合成。CGF内的血小板被活化后脱颗粒可导致大量生长因子释放，其中主要有5种代表性生长因子，包括转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor-bb，PDGF-BB)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和类胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)[10]。TGF-β1是一种对牙齿组织具有多种作用的复杂分子，可以在体外通过成牙本质细胞和成牙本质样的分化来诱导牙本质基质的上调；此外，TGF-β1能够在体内诱导牙髓干细胞介导的矿化和牙本质小管内矿化[13]。PDGF-BB和VEGF在组织再生过程中对血管生成起重要作用，研究表明[14]，PDGF-BB可以增加VEGF在成纤维细胞和血管内皮细胞中的表达，在PDGF-BB基因转染人牙髓干细胞(human dental stem cells，hDPSCs)后VEGF中mRNA的表达和蛋白质水平增加，hDPSCs分泌的PDGF-BB和VEGF可以增加血管生成的潜力。相关研究[15]表明，bFGF可以诱导牙周韧带成纤维细胞成骨分化，相反，抗bFGF抗体显著抑制CGF中骨钙蛋白、骨桥蛋白、osterix的表达。IGF-1对成骨细胞具有呈剂量依赖性的趋化作用[16]，已有研究[17]显示IGF-1参与骨折修复过程中成骨细胞的分化，并在协调软骨细胞、破骨细胞方面起重要作用。

2 CGF在牙髓再生中的作用

促进细胞增殖是牙髓再生的先决条件，CGF可明显提高细胞有丝分裂的潜力，促进牙髓内细胞的增殖，但不同浓度CGF之间的作用效果尚存在不一致性。Jin等[18]将hDPSCs用不同浓度的CGF提取物处理3d，通过荧光标记观察发现在高剂量(50%和80%)的CGF组中检测到更多hDPSCs的增殖，并且呈剂量依赖性。Jun等[8]研究发现，低于10%的CGF对人牙髓细胞(dental pulp cells，DPCs)具有加快生长作用，呈剂量依赖性，将浓度提高到15%后与10%浓度的CGF作用效果相同，无统计学差异。有其他学者[19-20]研究发现也得到相似的结论，1%～10%的CGF提取物对干细增殖呈剂量依赖性，而20%的CGF则具有抑制作用。尽管CGF对细胞增殖的影响有剂量依赖性，但随着CGF浓度的增加并不总是促进细胞增殖，类似结论在Qin等[21]研究CGF对施万细胞的增殖作用时也得到验证，认为可能是早期细胞较少时过量的生长因子对细胞增殖有一定抑制作用。以上对于不同浓度CGF对细胞增殖作用的研究均得到了不错的结果，提示CGF在促进细胞增殖上具有巨大潜力，尽管确切的机制尚不清楚，但低浓度CGF与其缓慢释放生长因子的特征相结合能产生最佳效果，这有利于CGF在体内作为支架的应用。

加速细胞迁移组织损伤再生修复的过程需要募集周边干细胞至受损区域或诱导受损区域干细胞定向分化，从而完成组织修复。RET的理论依据是在组织工程学基础上将干细胞募集至根管内定植，并在CGF所释放的生长因子作用下，通过调节细胞归巢诱导牙髓干细胞粘附在损伤部位，以替代原本的成牙本质细胞。Hong 等[10]将hDPSCs通过血清饥饿法培养后，分别加入浓度为10%、20%、50%、80%的CGF培养基中，通过体外伤口愈合试验评估CGF对hDPSCs的趋化活性，结果表明低浓度(10%和20%)CGF显著刺激细胞迁移，但是随着浓度增加，CGF的作用明显减弱甚至表现无作用，认为有可能高水平的白细胞、IL-1β和IL-6与高剂量CGF的负作用相关。Xu[22]等研究CGF对LPS刺激条件下hDPSCs迁移能力的影响发现，LPS组的迁移细胞数量比单纯CGF组的迁移细胞更多，且在LPS刺激作用的第一周内，CGF减弱IL-8的表达，表明CGF在LPS刺激下仍可以促进hDPSCs迁移，且对受炎症刺激的牙髓细胞具有抑制作用，提示CGF有助于感染根管内牙髓的修复和再生。

诱导成骨分化碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性可以决定CGF诱导成骨细胞分化的效果，其表达是成骨细胞分化的明显标志[23]。Chen 等[24]研究牙CGF对牙龈源性间充质干细胞(gingiva-derived mesenchymal stem cells，GMSCs)作用时，通过分析ALP的酶活性，发现CGF的ALP活性最高，提示CGF可以诱导GMSCs的成分化，进一步通过在第7、14、24d进行茜素红染色，在21d矿化结节最普遍，成骨诱导明显，通过比较分析，证明在加入CGF实验组中的矿化结节出现较早，有更高的密度。另一方面，CGF上调牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix acidic phosphoprotein 1，DMP1)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)和矮小相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)的mRNA表达，可能CGF通过调节dSPP、dMP1、BMP2和RUNX2的表达来促进GMSCs细胞的成骨细胞分化，蛋白印迹法结果与RT-qPCR结果一致，支持CGF上调DSPP、DMP1、BMP2、RUNX2促进干细胞成骨分化的假说。有其他学者[9]研究证明CGF通过不同信号通路蛋白加速矿化，促进矿化结节形成。Hong等[25]观察CGF对根尖乳头干细胞(stem cells of apical papilla，SCAPs)的作用时，发现ALP、DMP-1、 DSP、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)的表达在前7d受抑制，在14d后相关基因表达上调，该结果与之前相关研究结果并不一致，可能的原因是不同实验使用的是不同细胞以及CGF中含有部分炎症因子抑制SCAPs的分化。值得一提的是，有研究[26]表明冻干制剂的CGF在早期较缓释制剂的CGF在成骨上有更优异的表现，在后期缓释制剂的CGF在成骨矿化作用上有更显著优势，提示可能不同制剂的CGF在成骨作用上也存在差异。

增加血管生成在生理或病理情况下，VEGF能刺激血管内皮细胞的迁移和增殖，是介导血管生成最有效的生长因子，它的调节对于牙髓再生中新生血管的形成至关重要，被认为是淋巴管，血管生成的主要信号蛋白[27-28]。Jun等[8]研究CGF对人牙髓细胞血管生成作用时，用浓度为2%、5%、10%的CGF分别处理DPCs，在培养0、12、24、36h后经RT-qPCR测定，经比较发现PDGF、趋化因子受体4(chemokine receptor type 4，CXCR4)和VEGF的mRNA表达均显著升高，该表达呈剂量依赖性；同时观察发现VEGF和CXCR4的表达也呈现一致的结果，在培养4h后细胞开始形成管状结构，CGF组管状结构形成数量显著增加，并呈剂量依赖性。另外，Xu 等[22]研究发现，将CGF填充至根管内不仅能促进牙髓样组织再生，并且其具有类似天然组织的血管结构，为牙髓血运的重建提供结构基础。

3 总结与展望

总的来说，CGF不仅在制备上拥有快速、简单、方便的特点，含有丰富的生长因子使其可以募集根尖周围区域的干细胞，诱导如hDPSCs等干细胞增殖、迁移和分化，形成再生的牙髓样组织，并具有血管样结构。已有研究[29]表明，用更低的离心速度和更短的时间可能有利于增加PRF释放生长因子，增加成纤维细胞增殖迁移，其结果直接影响组织再生，CGF以较低的离心速度和时间制备也有望成为未来的趋势。目前为止，CGF作用于组织细胞时所释放的多种生长因子相互之间协同的机制还未阐明，临床治疗的预后评估研究数据较少。因此，相关体内外研究和临床实验的开展将有助于进一步探索CGF在牙髓再生中与不同组织细胞的相互作用机制，为其临床应用提供更为广阔的前景。