井冈霉素A在玉米幼苗中的吸收机理初探

张洪珍，樊 娟，赵 微，胡安龙

(1.贵州大学 作物保护研究所，贵阳 550025；2贵州大学 农学院，贵阳 550025)

井冈霉素属于氨基糖苷类抗生素，是我国科研人员于20世纪70年代在井冈山地区分离到的一种吸水链霉菌产生的物质[1]；含 8种主要活性成分，农用井冈霉素中成分 A 的含量最高约占 60%[2]。Gams和VanLaar[3]发现了井冈霉素能够抑制62种常见真菌，对植物真菌病害防治具有很好的应用前景，尤其是对立枯丝核菌的抗菌活性强，所以井冈霉素自研发以来常被用于防治由立枯丝核菌造成的农作物病害，如水稻纹枯病、玉米纹枯病和棉花立枯病等。据 Asano[4]等和Shigemoto等[5]报道，井冈霉素A在纹枯病病菌胞内会被水解产生井冈羟胺A，井冈羟胺A能抑制真菌内海藻糖酶的活性，进而影响纹枯病菌的能量代谢活动，阻碍病菌从菌丝基部向菌丝顶端运送葡萄糖，最终抑制菌丝的生长。

前人研究表明氨基糖苷类抗生素春雷霉素在烟草、玉米中能通过叶片输导至根部[6]。细菌对氨基糖苷类抗生素的摄取是需氧耗能的主动转运过程，如大肠杆菌对链霉素的吸收[7]。目前对氨基糖苷类抗生素的吸收与转运研究主要集中在动物细胞及细菌的吸收，对植物吸收研究很少。关于井冈霉素的研究主要集中在生物合成[8]、作用机制[9]、田间防效[10]、残留[11]等方面，对于井冈霉素A在植株体内的内吸特性目前尚无相关研究报道。基于井冈霉素A与春雷霉素类似的化学结构，笔者推测它们在植物体内具有类似吸收特性，因此以玉米幼苗为研究对象，模拟田间喷雾法，采用高效液相色谱串联质谱技术探究了玉米幼苗对井冈霉素A的吸收特性及机理，以期探明该药剂在玉米中的吸收方式和初步判断其转运基团，为田间科学合理用药，及为以此基团介导的导向农药研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1290型高效液相色谱仪、 6470型质谱仪(美国Agilent )；ST16RThermo型冷冻离心机(赛默飞世尔科技)；XW-80A 型涡旋混合器(上海精科实业有限公司)；CPA225D型电子天平(德国赛多利斯股份公司)。

玉米种子(贵州大学作物遗传所赠送)；井冈霉素A原药(98%，阿拉丁试剂有限公司)；氰化羰基间氯苯腙(CCCP)(98%，天津希恩思生化科技有限公司)；二硝基酚(DNP)(98%，麦卡希试剂有限公司)；D-葡萄糖、根皮苷(98%，阿拉丁试剂有限公司)；N-丙基乙二胺(PSA)(98%，天津希恩思生化科技有限公司)均为市售国产分析纯产品；超纯水，采用 Millipore Milli-Q (美国密立波公司)系统制备。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米培养方法

精选适量饱满的种子(金优785)，于28℃条件下用无菌水浸种催芽24 h，然后将种子均匀撒播在土壤表面，覆土，用喷壶洒水浸湿土壤。室内培养(光照/黑暗：16 h/8 h)，室温(25±2) ℃，用加湿器使室内湿度保持在85%左右。以培养3周左右的玉米幼苗为供试材料。

1.2.2 施药方法

98%井冈霉素A以超纯水稀释配制质量浓度为0.1 mmol/L的溶液，于玉米幼苗2~3叶时采用叶面均匀喷雾。以在叶面刚好形成一层药膜而不流下为宜，喷雾前用保鲜膜包裹根茎部，防止根茎部接触药剂。每个处理重复3次，以超纯水处理玉米为对照，于相同条件温室培养。在喷药后12 h，取基部茎于－20 ℃保存，备用。

1.2.3 样品前处理

称取2.00 g (精确到0.01 g)已匀质化的玉米茎样品于10 mL离心管中，加入4 mL提取溶液(甲醇∶水为9∶1)，涡旋振荡提取2~3 min；加入1 g氯化钠，涡旋振荡1 min，于4 000 r/min下离心5 min；取1 mL上清液至2 mL离心管中，加入30 mg PSA，涡旋振荡30 s，于12 000 r/min下离心5 min；取上层净化液1 mL，过0.22 μm有机滤膜，待HPLC-MS/MS检测。

1.2.4 不同pH、温度以及底物浓度对玉米吸收井冈霉素A的影响

⑴ 用柠檬酸和氢氧化钾将井冈霉素A药液pH调至4、5、6、7、8、9 (井冈霉素A药液最终浓度为0.1 mmol/L)，将上述不同pH的井冈霉素A溶液按照1.2.2节的方法喷施在玉米幼苗叶片上，12 h后取茎部进行测定。

⑵ 将井冈霉素A配制成浓度为0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0 mmol/L 6个浓度梯度(pH=5)，均匀喷于长势良好的玉米叶片，12 h后取茎部进行测定。

⑶ 将井冈霉素A溶液配制成浓度为0.1 mmol/L(pH=5)，于24 ℃与4 ℃环境条件下喷施在玉米叶片，12、15、18 h后分别取茎部进行测定。

1.2.5 能量抑制剂对玉米吸收井冈霉素的影响

分别将含有0.3、0.5、0.7 mmol/L的CCCP和0.1、0.15、0.25 mmol/L的 DNP溶液以及 3、6、9 mmol/L的D-葡萄糖和0.25、0.5、1 mmol/L的根皮苷分别喷于玉米叶片1 h后，再将浓度为0.1 mmol/L井冈霉素A溶液(pH=5)均匀喷于其叶片，室内培养12 h后取茎部进行测定；探究不同能量抑制剂及竞争性底物对玉米吸收井冈霉素A的影响。

1.3 井冈霉素A的色谱测定条件

液相色谱条件：流速0.15 mL/min，柱温350 ℃，进样量5 μL；流动相A：0.1%的甲酸水(70%)；B：乙晴(30%)；运行时间5 min。

质谱条件：电喷雾(ESI)离子源；正离子扫描；多反应监测(MRM)模式；碎裂电压155 V；碰撞能量(CE)：对于 178.1、336.1两个子离子分别设定为25 V、20 V；定性离子对：m/z498.2/178.1、m/z498.2/336.1；定量离子对：m/z498.2/178.1[12]。

1.4 标准曲线及添加回收试验

98%井冈霉素A用超纯水溶解，配制成质量浓度为10 mg/L母液，用超纯水稀释成浓度为0.01、0.625、1.25、2.5、5 μg/L系列标准工作液，按 1.3节色谱测定条件测定标准曲线。空白玉米茎部样品中加入一定量井冈霉素A 标准工作溶液，使其添加质量浓度分别为0.05、0.1、0.5 mg/kg，每个质量分数进行3次重复试验。按1.2.3节的方法进行样品前处理，按 1.3节色谱条件测定，计算玉米茎部添加回收率和相对标准偏差。

1.5 数据处理

酶促反应动力学参数计算如下：1/V=Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax，式中：V为酶促反应速率(mmol/L/h)；Km为米氏常数 (mmol/L)；Vmax为最大酶促反应速率(mmol/L/h )；[S]为底物浓度 (mmol/L)。所有试验进行多次验证统计结果，每组处理玉米数为10株，重复3次。使用DPS10.0，Duncan法对试验获得的数据结果进行差异显著性分析。95%的置信区间具有统计学意义*p＜0.05 和**p＜0.01。

2 结果与分析

2.1 方法的线性、精密度和准确度

由图2可知，目标检测物的保留时间为0.796 min，且附近没有其他干扰色谱峰。标准曲线线性回归方程为y=4.893 75x+41.548 78，相关系数为0.999 5。由表1可知，在0.05、0.1、0.5 mg/kg添加水平下，井冈霉素A在玉米茎部的平均回收率为91%~93%，相对标准偏差为2.1%~4.5%，低于10%。按信噪比为3 (S/N=3)计算检出限，可得检出限为0.003 μg/L，表明建立的方法适用于玉米幼苗样品中井冈霉素 A的检测。

图2 井冈霉素A标准样品色谱图(左)及在玉米茎部提取液的典型色谱图(右)

表1 井冈霉素A在玉米茎部的添加回收率及相对标准偏差

2.2 玉米幼苗吸收井冈霉素A的时间曲线

为了探究井冈霉素A在玉米中吸收情况，将0.1 mmol/L井冈霉素A药液按照1.2.2节的施药方法，将其均匀喷在玉米叶片上，于3、6、9、12、15、18 h后取样测定。结果如图3所示，在3~12 h内井冈霉素A吸收量不断上升，在12 h达最大值461.85 μg/L后呈现出下降趋势，施药后12 h设为后期试验取样时间。

图3 玉米叶片吸收井冈霉素A的时间曲线

2.3 酸碱性对玉米幼苗吸收井冈霉素A影响

农药的吸收受很多因素影响，包括植物表层组织结构、农药分子大小、水溶性离子性和亲质性及酸碱性。本试验用柠檬酸和KOH将井冈霉素A药液pH调至4、5、6、7、8、9。将上述不同pH的井冈霉素A喷于玉米叶片12 h后取样，以不同pH作为横坐标，井冈霉素A吸收量为纵坐标绘图，见图4。可见，井冈霉素A吸收量随着其溶液碱性增强而呈逐渐下降趋势，pH=5时井冈霉素A的吸收量最大(468.75 μg/L)，后吸收量随着pH升高而降低，特别是pH=9时下降到146.92 μg/L，与pH=5时相差几乎3倍，说明玉米幼苗吸收井冈霉素A受酸碱性的影响。

图4 pH对玉米叶片吸收井冈霉素A影响

2.4 温度对玉米幼苗吸收井冈霉素A的影响

为了进一步探明玉米幼苗对井冈霉素A的吸收方式，分别将药液处理后的玉米置24 ℃和4 ℃下培养12、15、18 h后取样，检测玉米茎部井冈霉素A的含量，结果见图5。可见，2种温度处理下，井冈霉素A的吸收量都随着时间的增加而显著减少，且最大吸收量都出现在12 h，分别为453.47 μg/L和155.31 μg/L。低温处理显著比常温处理下吸收量低，说明玉米幼苗对井冈霉素A的吸收受温度影响。

图5 温度对玉米叶片吸收井冈霉素A的影响

2.5 浓度对玉米幼苗吸收井冈霉素A的影响

将质量浓度分别为0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mmol/L的井冈霉素 A药液喷于玉米12 h后，在玉米基部茎中均能检测到井冈霉素A，见图6。可见，玉米幼苗对低浓度(0.031 25~0.125 mmol/L)井冈霉素A吸收成近直线关系，随着浓度的升高，吸收速率逐渐下降，0.25 mmol/L时吸收几乎达到饱和。浓度大于0.25 mmol/L时，吸收曲线呈线性关系，说明玉米叶片对井冈霉素A的吸收具浓度依赖性，利用 Hill模型计算得出，其动力学参数为：Km=0.001 mmol/L、Vmax=0.04 mmol/(L/h)，说明玉米幼苗对井冈霉素A的吸收是在低浓度下主动运输为主。

图6 浓度对玉米叶片吸收井冈霉素A的影响

2.6 能量抑制剂对玉米幼苗吸收井冈霉素A的影响

CCCP和DNP作为氧化磷酸化的解偶联剂，可抑制线粒体细胞产生能量(三磷酸腺苷，ATP)，是转运蛋白能量抑制剂，可用作进一步确认玉米幼苗对井冈霉素A吸收是否为耗能主动运输的依据。试验结果见图7，由图7可知，加了能量抑制剂的两组处理与未加的空白对照相比，处理12 h后，对照处理吸收量高达453.47 μg/L，而加入能量抑制剂的两组处理最低吸收量分别为180.26 μg/L和294.16 μg/L。井冈霉素A的吸收量都受到了显著抑制，最大浓度处理组抑制作用分别达60.25%、35.13%，说明玉米叶片吸收井冈霉素A是耗能过程。

图7 能量抑制剂(CCCP、DNP)对玉米叶片吸收井冈霉素A的影响

2.7 竞争性底物对玉米叶片吸收井冈霉素A的影响

由图8可知，加入D-葡萄糖处理与空白对照相比，井冈霉素A吸收量受到了明显的抑制，从453.47 μg/L降低至378.01、330.97、261.85 μg/L，抑制率分别为16.64%、27.01%、42.26%。加入葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂根皮苷后，井冈霉素A吸收量也受到了显著的抑制，分别降低至283.94、228.72、150.00 μg/L，抑制率分别为37.39%、49.56%、66.87%，说明玉米对井冈霉素A吸收有单糖转运蛋白的参与。

图8 竞争性底物(根皮苷、D-葡萄糖)对玉米叶片吸收井冈霉素A的影响

3 讨论与结论

根据酶动力学原理，Vmax表示载体饱和时所能达到的最大吸收速率，其值愈大，表示其吸收离子的潜力愈大；Km为载体对吸收离子亲和力的倒数，其值愈小表示植物对外源物质的亲和力就越大[13]。本研究结果表明玉米叶片对井冈霉素A的吸收在一定时间内随时间增加呈先增后降，且具有浓度梯度依赖性，不同底物浓度呈现不同吸收速率。玉米叶片对低浓度(0.03125~0.125 mmol/L)井冈霉素A的吸收具有饱和性，0.25 mmol/L时几乎达饱和，高浓度下(0.5~1.0 mmol/L)，吸收曲线呈线性关系，其吸收符合Michaelis-Menten动力学模型，得到动力学参数为Km=0.001 mmol/L，Vmax=0.04 mmol/(L/h)。主动吸收是一个耗能过程，需要电化学势质子梯度和ATP结合蛋白-载体，或是受H+-ATP泵驱动的过程[14]。温度是影响酶和载体活性的重要因素[15-16]，低温通过降低合成ATP所需的线粒体ATPase和丙酮酸激酶的活性，而使腺苷酸，尤其是ATP水平明显下降，从而导致代谢过程发生紊乱，使ATP的利用速度明显超过合成速度。陆守昆等[17]发现低温能抑制小麦对菲的主动吸收。相关研究表明，作物在24 ℃下对农药的吸收量与4 ℃下的吸收量之比Q10值小于或大于2.0，可作为判断作物对农药的吸收是与生物代谢有直接联系还是属于被动物理过程的标准[18]。本研究结果显示玉米叶片对井冈霉素A的吸收对温度和pH都敏感，在4 ℃、24 ℃，井冈霉素A吸收量显著不同，各处理组的Q10值均大于2，与前人研究结果一致，说明玉米叶片对井冈霉素A的吸收属于主动过程，可以判断其吸收有转运载体的参与。沈静等[19]研究得出不同 pH直接影响玉米细胞质子泵基因表达，并间接影响到玉米对外源物吸收。Michelet等[20]研究发现植物质膜ATPase活性存在一个最适pH。pH会导致质子浓度发生改变，而葡萄糖转运蛋白大多是质子浓度驱动型[21]。本研究发现pH的变化对作物吸收井冈霉素的影响较大，在pH=5时的吸收量468.75 μg/L是pH=9时的3倍，推测玉米叶片吸收井霉素A有单糖转运蛋白参与。

CCCP是一种解偶联剂，其是否能够影响植株对某种化合物的吸收，作为判断该吸收过程需要能量与否的标志[22]。赵俊龙等[23]发现能量抑制剂CCCP对甘氨酸-氟虫腈具有显著抑制效果。胡安龙等[24]曾在烟草细胞吸收春雷霉素研究中使用了能量抑制剂(CCCP)，证明了烟草细胞吸收春雷霉素是耗能的过程。Hetherington等[25]的研究表明，玉米和大豆悬浮细胞对外界低浓度除草剂草甘膦的吸收属于主动吸收，该吸收过程受CCCP所抑制。氧化磷酸化抑制剂 2,4-二硝基苯酚(DNP)抑制了植物对碘酸盐的吸收[26]，DNP对钾和钠离子的吸收敏感。DNP和CCCP能明显抑制细菌对氨基糖苷类抗生素的吸收，表明其吸收是耗能的主动吸收[27]。本试验用氧化磷酸化抑制剂DNP和能量抑制剂CCCP对玉米处理后喷药，结果与前人一致，玉米叶片对井冈霉素A的吸收都被抑制，表明玉米叶片吸收井冈霉素A需要能量。葡萄糖是动植物等细胞所必需的代谢物质，根皮苷是钠-葡萄糖转运蛋白的竞争性抑制剂，能抑制糖的吸收，董华强等人研究发现根皮苷对糖尿病小鼠有显著降血糖血脂效果，因为根皮苷能有效地抑制葡萄糖协同转运蛋白(SGLT1/SGLT2)对葡萄糖分子的运输[28]。所以采用根皮苷和D-葡萄糖处理后，再进行井冈霉素A药剂喷施，发现井冈霉素A的吸收量受到显著抑制，由此推测D-葡萄糖的加入对玉米吸收井冈霉素A产生了竞争，可初步判断这与井冈霉素A本身化学结构中的D型葡萄糖基团有关，且进一步佐证此吸收过程有单糖转运蛋白的参与。

井冈霉素A喷施于玉米叶面上后，具有向基传导能力，且玉米叶片对药剂的吸收受低温、CCCP、DNP、pH、D-葡萄糖和根皮苷等的影响，且是一个由载体蛋白介导的主动吸收过程。2004年有人提出农药有效活性成分与导向载体偶联后能在植物体内向定向累积的导向农药概念[29]，井冈霉素A化学结构包含有效氧胺A基团和D-葡萄糖基团，井冈霉素能在D-葡萄糖基团的介导下先进入真菌细胞，而有效氧胺A基团随之进入真菌细胞发挥生物学效应[44]。本研究结果与之一致，可初步判断D-葡萄糖基团对玉米叶片吸收井冈霉素A起重要作用，这不仅为井冈霉素A防治作物根部病害提供科学依据，而且还可为植物中具有双向输导和靶向积累性、以D-葡萄糖为导向基团的新农药分子设计和合成提供理论支撑。