父本对无核葡萄‘Afrodita’胚培养的影响研究*

闫爱玲，王慧玲，孙 磊，张国军，王晓玥，任建成，徐海英

（北京市林业果树科学研究院，北京市落叶果树工程技术研究中心，农业农村部华北园艺作物生物学与种质创制重点实验室，100093）

无核葡萄作为重要的鲜食和制干品种，深受人们的喜爱。目前无核葡萄品种是我国各葡萄产区的主推品种[1]，发展无核葡萄已成为当前鲜食葡萄生产的一种趋势。因此越来越多的育种工作者参与到无核葡萄育种研究工作中[2-14]，无核胚挽救成为无核葡萄育种的主要方法之一。‘Afrodita’是引自保加利亚的种子败育型葡萄品种，该品种平均单粒重6.5 g 左右，丰产，果皮黄绿色，果肉质地中，可溶性固形物含量16%，果实成熟期8 月下旬，是果穗和果粒都较大的无核品种。但其缺点是口感淡，风味不足，且残核涩味比较明显。我们想通过该品种与其他无核或香味品种杂交获得口感更好的或有香味的无核后代，所以近2 年我们开展了该品种及其杂交胚的胚挽救研究工作，并对不同父本对‘Afrodita’杂交胚挽救的影响做了探讨，也希望能为其他无核品种的胚挽救培养提供借鉴。

这些年，我们在无核葡萄胚挽救工作中积累了一些经验[3-4]，对于影响无核葡萄胚挽救育种效率的因素也有了更深入的了解[5-17]。在无核葡萄‘Kismis’的胚挽救技术研究中[4]，我们做了种子发育观察试验，得出了“从胚发育来看从心形胚到鱼雷胚开始出现这个阶段采样最好”的结论。因此对于‘Afrodita’这个品种的胚挽救，根据胚的发育进程，我们的取样时期从授粉后1个月起，到2个月结束，希望从中筛选出该品种最适宜的采样期。根据多年经验及查阅文献[4-11]，在培养基中添加了水解酪蛋白和活性炭作为基本成分之一，选取GA3、IAA 作为被筛选的植物生长调节剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2018 年4 月至2019 年12 月在北京市林业果树科学研究院葡萄实验地及实验室进行。供试无核品种‘Afrodita’，无核、具香味品种‘爱神玫瑰’‘寒香蜜’‘无核翠宝’，无核、大粒品种‘瑞都无核怡’，品质优良的晚熟品种‘克瑞森无核’和具香味、早熟品种‘早玫瑰香’。所用的杂交组合为‘Afrodita’ב爱神玫瑰’、‘Afrodita’ב寒香蜜’、‘Afrodita’ב无核翠宝’、‘Afrodita’ב瑞都无核怡’、‘Afrodita’ב克瑞森无核’、‘Afrodita’ב早玫瑰香’及‘Afrodita’自然杂交。

1.2 试验方法

1.2.1 田间杂交

在始花期采集正常发育父本花序，收集花粉。于开花前1～3 d 对母本进行去雄，去雄后第2 d 进行授粉，连续授粉3 d。去雄后及每次授粉后立即套袋。每个组合杂交15 穗。

1.2.2 幼果采集和处理

将采下的幼果带回实验室，将果穗剪成4～5粒的小穗，放入烧杯中，用自来水冲洗1～2 h，再在超净工作台上，先用75%酒精漂洗1次，再用0.1%升汞消毒7～8 min，最后用无菌水漂洗3 次。用解剖刀取出胚珠接种在内装40 mL 培养基的100 mL三角瓶中，每瓶接种4～6 枚，放在培养室内培养。

1.2.3 发育培养

（1）2018 年首次授粉30 d 后开始，每10 d 采摘1 次‘Afrodita’ב爱神玫瑰’、‘Afrodita’ב瑞都无核怡’、‘Afrodita’ב克瑞森无核’和‘Afrodita’自然杂交的杂交幼果，每次150 粒，共取4 次样，接种在W1 培养基中。

（2）2019 年授粉50 d 后采集‘Afrodita’ב爱神玫瑰’、‘Afrodita’ב寒香蜜’、‘Afrodita’ב无核翠宝’、‘Afrodita’ב瑞都无核怡’、‘Afrodita’ב克瑞森无核’、‘Afrodita’ב早玫瑰香’、‘Afrodita’自然杂交的杂交果接种在以下4 种培养基中：W1 为改良MS＋500 mg/L 水解酪蛋白＋60 g/L 蔗糖＋6.5 g/L 琼脂＋1.5 g/L 活性炭，W2 为NN＋500 mg/L 水解酪蛋白＋60 g/L 蔗糖＋6.5 g/L 琼脂＋1.5 g/L 活性炭，W3 为改良MS＋0.5 mg/L GA3＋1.5 mg/L IAA＋500 mg/L 水解酪蛋白＋60 g/L蔗糖＋6.5 g/L 琼脂＋1.5 g/L 活性炭，W4 为NN＋0.5 mg/L GA3＋1.5 mg/L IAA＋500 mg/L 水解酪蛋白＋60 g/L蔗糖＋6.5 g/L琼脂＋1.5 g/L活性炭，25 ℃下，光照强度1 600 lx 培养。

1.2.4 胚萌发阶段胚培养

胚发育培养60 d 后剥胚，剥胚时，统计胚发育情况。若解剖镜下看到亮白色胚，视为胚发育；若所剥胚珠内无亮白色胚（胚珠内无胚或胚褐化），视为胚败育。将发育的胚接种到胚萌发培养基1/2MS＋0.2 mg/L IBA＋20 g/L 蔗糖＋6.5 g/L 琼脂＋1.0 g/L活性炭中继续培养，pH 值5.8，25 ℃培养。培养30 d 后调查胚萌发率。

对于（1）处理统计4 次取样时期的幼胚发育率（W1，25 ℃）与萌发率，确定不同杂交组合最佳取样时期。对于（2）处理比较各杂交组合在授粉后50 d 取样杂交胚的胚发育率（W1～W4，25 ℃）和萌发率；胚发育培养60 d 后分别统计胚发育率，研究不同培养基对7个杂交组合胚发育率的影响。

1.3 数据处理与分析

所有数据采用Excel 2003 进行处理，采用SPSS 18.0 软件进行统计分析和差异比较。

2 结果与分析

2.1 父本对取样时期确定的影响

选取了父本为早熟的‘爱神玫瑰’、中熟的‘瑞都无核怡’及晚熟的‘克瑞森无核’3个组合和自然杂交的胚为试材，来确定最佳取样时期。从表1可以看出，除了‘Afrodita’自然杂交，其他3个杂交组合‘Afrodita’ב爱神玫瑰’、‘Afrodita’ב瑞都无核怡’、‘Afrodita’ב克瑞森无核’均以授粉后50 d 取样的胚发育率和萌发率最高，显著高于其他取样时期，胚发育率分别为27.52%、32.17%、9.30%，胚萌发率分别为12.84%、18.20%、5.81%。‘Afrodita’自然杂交50 d 和60 d 取样的胚发育率和萌发率均差异不显著，胚发育率分别为26.38%和 27.40%，胚萌发率分别为 15.95%和16.12%。可见，最佳取样时期与母本的胚发育进程密切相关，与父本成熟的早晚无关。

表1 不同取样时期离体胚珠生长发育情况

2.2 父本对幼胚生长发育的影响

从表2 可以看出，父本不同，杂交胚的发育和萌发率也不同。亲本无核交有核的组合‘Afrodita’ב早玫瑰香’杂交胚的发育率和萌发率（38.70%、22.58%）均高于其他5个亲本无核交无核的组合。父本有核有利于杂交胚的发育，但是却降低了后代的无核率。在亲本无核交无核的组合中，父本为‘无核翠宝’的胚发育率（34.72%）较高，显著高于除‘Afrodita’ב瑞都无核怡’外的其他3个无核亲本；胚萌发率18.05%，显著高于其他4个无核亲本。父本‘瑞都无核怡’的胚发育率（35.33%）较高，但萌发率（14.00%）却不高。‘Afrodita’自然杂交的胚发育率（31.90%）显著低于‘无核翠宝’和‘瑞都无核怡’作父本的，但胚萌发率（20.85%）却比二者要高。‘Afrodita’ב克瑞森无核’杂交组合无论胚发育率还是萌发率都是最低的，分别为15.78%、7.89%。

表2 不同杂交组合幼胚生长发育情况

2.3 不同发育培养基对幼胚发育率的影响

从表3 可以看出，除了‘Afrodita’ב无核翠宝’和‘Afrodita’ב克瑞森无核’2个组合外，其他5个组合的胚发育率都是基本培养基为改良MS 的W1、W3 培养基较基本培养基为NN 的W2、W4 培养基高，其中‘Afrodita’ב瑞都无核怡’的杂交胚更适合生长在添加了植物生长调节剂的W3 培养基中，‘Afrodita’ב爱神玫瑰’、‘Afrodita’ב寒香蜜’、‘Afrodita’ב早玫瑰香’和‘Afrodita’自然杂交这4个组合胚发育率较高的都是W1 培养基。‘Afrodita’ב无核翠宝’组合的胚发育率是添加植物生长调节剂的W3、W4 培养基均显著高于不添加植物生长调节剂的W1、W2 培养基，该组合胚发育较合适的培养基是W3。‘Afrodita’ב克瑞森无核’组合的胚发育率是基本培养基为NN 的W2、W4 培养基均显著高于基本培养基为改良MS的W1、W3 培养基，该组合胚发育较合适的培养基是W4。

表3 不同发育培养基胚珠发育情况

3 讨论与结论

在胚挽救技术中，母本基因型和取样时期对胚挽救效率的提高有关键作用。我们在最佳取样时期试验中选取了父本为早熟的‘爱神玫瑰’、中熟的‘瑞都无核怡’及晚熟的‘克瑞森无核’3个组合的杂交胚为试材，研究父本的成熟期对杂交胚发育时期的影响。结果表明，这3个杂交组合均在授粉后50 d 取样的胚发育率和萌发率显著高于其他取样时期，说明父本的成熟期对杂交胚的生长发育无影响，最佳取样时期与母本胚发育进程密切相关。这个结果再次验证了我们在前些年的结论[3-4]，且同田淑芬等[2]、李志瑛等[10]、史文静等[12]、屈田田等[13]的结论一致，同时也说明母本胚珠的发育程度是胚挽救取样时期的关键[14-19]。

在父本对幼胚生长发育影响的试验中选取了1个有核父本和5个无核父本，研究父本的有核或无核对杂交胚发育的影响。结果发现，不同父本的组合，杂交胚的发育和萌发率均不同，这也说明亲本基因型是影响胚挽救结果的一个重要因素[12,20-25]，且不同父本胚挽救率不同[14]。父本有核的组合‘Afrodita’ב早玫瑰香’杂交胚的发育率和萌发率均高于其他5个无核的组合，这个结果与朱佩佩试验中有核父本胚发育率与萌发率高于无核父本的结果是一致的[26]，说明父本的有核或无核能影响杂交胚的发育，且父本有核可能有助于提高杂交胚的坐果率，从而提高了杂交胚的发育率。马丽等[27]认为有核品种作父本的果实内可溶性糖、K、Mg 含量均高于无核品种作父本的果实，这说明可溶性糖、K、Mg 等可能有助于胚珠的生长发育，从而提高了胚挽救率。一般情况下无核葡萄的胚和胚乳的消失是受到基因严格调控的[28]，有核父本其胚和胚乳是不会消失的，也可能有利于杂交胚的发育。不同品种的基因型不一样，种胚继续发育和成苗能力也存在着显著差异。不同父本杂交胚发育率和萌发率的差别也有可能与父本花粉活力及与母本的杂交亲和力的差别有关[20,29]。

胚发育培养基为离体胚珠提供了幼胚发育所需的激素和营养物质，直接影响到胚能否存活和进一步发育，因此胚发育培养基是胚挽救成功的关键因素之一。一般认为，胚发育的基本培养基使用Nitsch 或NN、MM3[20,30-31]较好，激素以赤霉素和生长素最为重要[9]，基本培养基中添加水解酪蛋白[11]和活性炭有助于胚发育和成苗。本试验中‘Afrodita’ב瑞都无核怡’、‘Afrodita’ב寒香蜜’、‘Afrodita’ב爱神玫瑰’、‘Afrodita’ב早玫瑰香’4个组合和‘Afrodita’自然杂交适宜的基本培养基为改良MS，‘Afrodita’ב克瑞森无核’组合适宜的基本培养基为NN，‘Afrodita’ב无核翠宝’组合NN 培养基与改良MS 培养基差异不大。0.5 mg/L GA3＋1.5 mg/L IAA 可以提高‘Afrodita’ב无核翠宝’、‘Afrodita’ב瑞都无核怡’2个组合的杂交胚发育率，其他5个组合有可能基本培养基添加了水解酪蛋白和活性炭就能满足杂交胚的发育，也有可能GA3和IAA 组合和浓度不适宜，需要进一步试验确定。

本试验研究表明，相同母本最适的基础培养基大体相同，不同父本对杂交幼胚的生长发育影响不同，所需植物生长调节剂的组合和浓度配比不同。以无核葡萄‘Afrodita’为母本的杂交后代培养技术及程序为：授粉后50 d取胚珠，在25 ℃下，改良MS＋500 mg/L 水解酪蛋白＋60 g/L 蔗糖＋6.5 g/L琼脂＋1.5 g/L 活性炭为基础培养基，添加或不添加0.5 mg/L GA3＋1.5 mg/L IAA 的培养基上进行发育培养，剥胚后将胚转移到1/2MS＋0.2 mg/L IBA＋20 g/L 蔗糖＋6.5 g/L 琼脂＋1.0 g/L 活性炭的培养基上萌发生长。