鹿羊颗粒对去卵巢大鼠骨密度的影响

王玉，赵宏宇，刘新宇，邸琳

（吉林省中医药科学院，吉林长春130012）

女性绝经期后，由于卵巢功能减退，内源性雌激素分泌减少，导致骨重建失衡，骨吸收大于骨形成，从而导致绝经期女性骨质疏松[1]。中药防治骨质疏松症是临床医学中的一个治疗手段，在治疗骨质疏松方面有独特的疗效，中药增加了钙吸收率，改变骨组织结构等机理防治骨质疏松[2-4]。

在中医理论中，淫羊藿中有效成分是淫羊藿苷，通过补肝肾、强筋骨而达到治疗目的，以其补肾阳，益肾精之功而为君药[5]。骨碎补有增加骨密度和骨强度作用，能促进骨细胞骨形态形成[6]。鹿骨主治虚劳骨弱、风湿痹痛等，具有补虚羸，强筋骨等功效[7,8]。本研究以去卵巢所致骨质疏松大鼠为研究对象，鹿羊颗粒为受试物，研究受试物对去势大鼠的骨重量、骨密度和骨病理的影响，并检测Ⅰ型胶原蛋白C末端肽（CTX-1）、Ⅰ型原胶原N端前肽（PINP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、骨碱性磷酸酶（BALP）和骨钙素（BGP;OCN）等骨吸收和破骨细胞活性的标志物[9,10]。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

72只SPF级SD雌性大鼠，体重（200±20）g，长春亿斯，动物许可证：SCXK（吉）-2018-0007，实验动物符合伦理委员会规定。

1.2 药物

鹿羊颗粒，主要成分为淫羊藿和骨碎补水提取物及鹿骨粉，吉林省中医药科学院自制；注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司；补佳乐（戊酸雌二醇），DELPHARMLille S.A.S；戊巴比妥钠，上海化学试剂分装厂，批号：84-06-12；CTX-1、PINP、TRAP、BALP、BGP;OCNELISA试剂盒，武汉华美生物工程有限公司。

1.3 仪器

HH-8型数显恒温水浴锅，常州市凯航仪器有限公司；Direct-Pure System超纯水系统，购自Rephile Bioscierce，Ltd；DNM-9602型酶标仪，北京普朗新技术有限公司；Pl403型天平，METTLERTOLEDO；LQ-C5001精密天平，上海瑶新电子科技有限公司；SX2-2.5-10型马弗炉，上海喆钛机械；双能X射线骨密度仪，Ultra-Focus，VIS-10 15，美国Faxitron。

2 试验方法

2.1 制备大鼠去卵巢模型及分组给药

雌性大鼠72只，选取60只大鼠作为手术组。禁食12～16 h，大鼠称重，用戊巴比妥钠麻醉后，俯卧，沿脊柱两侧2 cm处周围剃毛备皮，消毒后在距肋骨下方和脊柱两侧2 cm处分别切开1 cm大小切口，切口视野直达腹腔，露出卵巢脂肪团，拉出脂肪团与部分子宫，扎紧卵巢与子宫连接处，摘除双侧卵巢后放回腹腔，切口分层缝合后消毒。假手术组的12只大鼠采用相同手术步骤，拉出卵巢脂肪团，仅去掉部分脂肪后将卵巢与子宫放回腹腔，缝合。所有大鼠连续3 d肌注青霉素（4 104U/kg），以防感染。

术后7 d，手术组大鼠随机分为5组，分别为模型组、阳性药组（戊酸雌二醇）、鹿羊颗粒高剂量组、鹿羊颗粒中剂量组和鹿羊颗粒低剂量组。鹿羊颗粒高、中和低剂量组大鼠分别按4.5 g/（kg bw）、3 g/（kg bw）和1.5 g/（kg bw）灌胃鹿羊颗粒的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，阳性药组灌胃1.0 mg/（kg bw）补佳乐的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，假手术组和对照组大鼠灌胃0.5%羧甲基纤维素钠溶液，所有大鼠每日灌胃1次，灌胃溶液的体积均为10 mL/（kg bw），连续12周。每周称体重1次，根据体重调整给予受试物体积。

2.2 动物处理及测定指标

2.2.1 动物处理试验结束前大鼠禁食12 h，戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉，采用腹主动脉取血，剥离肌肉韧带等组织后，左侧股骨用于骨密度测定和骨钙测定，右侧股骨用于骨组织病理学检查。离心取血清，ELISA法测定血清中TRAP、BALP、BGP;OCN、CTX-1和PINP含量。

2.2.2 骨密度测定用双能X射线小动物骨密度仪直接扫描测定骨密度。

2.2.3 股骨指数和钙含量测定大鼠处死后，取左侧股骨放入烘箱中105℃烘至恒重后，称量重量。再置于电炉上碳化至无烟后，置于马弗炉中，550℃灰化至恒重，用股骨灰分加硝酸（1+1）消化，消化完全后加水定容，根据需要稀释后用EDTA溶液滴定（EDTA溶液使用前需测滴定度），分别计算骨钙含量。

2.2.4 抗酒石酸酸性磷酸酶、骨碱性磷酸酶、骨钙素、I型胶原蛋白C末端肽和I型原胶原N端前肽取血后离心，血清用ELISA试剂盒测定抗酒石酸酸性磷酸酶、骨碱性磷酸酶、骨钙素、I型胶原蛋白C末端肽和I型原胶原N端前肽。

2.2.5 骨组织病理学检查取大鼠右侧股骨，放入甲醛溶液浸泡后，进行HE染色，茜素红S染色。

3 实验结果

3.1 各组药物对大鼠体重的影响

由表1可见，模型组体重与假手术组相比，增重明显，具有显著性（P＜0.01），有研究报道雌激素对脂肪的合成代谢有抑制作用，雌性大鼠切除卵巢后，雌激素水平紊乱，所以大鼠脂肪沉积，造成了体重的增长[11-13]。与模型组相比，阳性药组为雌激素，所以大鼠体内雌激素减少量较小，体重均显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，高、中、低剂量组体重增重均无显著变化，但有增加趋势，分析原因可能是中药中滋补成分起的作用，增加了肌肉和骨的重量（P＞0.05）。

表1 实验药物对大鼠体重的影响Table 1 Effects of drugs on the body weight of rats

3.2 实验药物对大鼠股骨指数、骨密度及骨钙百分比的影响

由表2可见，模型组与假手术组比较，股骨指数、骨密度及骨钙百分比差异性显著（P＜0.01），并且数值显著低于假手术组；阳性药组和高剂量组与模型组比较，骨钙百分比和骨密度值显著增加（P＜0.05），中剂量组和低剂量组中骨钙百分比和骨密度值无显著性差异（P＞0.05）；阳性药组与模型组比较，股骨指数显著增加（P＜0.05），其他组的股骨指数差异不显著（P＞0.05）。

表2 药物对大鼠股骨指数、骨密度及骨钙百分比的影响Table 2 Effects of drugs on the weight ratio,bone calcium percentage,and bone density of the rat femur

图1为大鼠左侧股骨双能X射线扫描骨密度图， 每5只一张图片。

图1 骨密度扫描图片Fig.1 The scan image of the bone mineral density

3.3 药物对大鼠的TRAP、BALP、BGP;OCN、CTX-1和PINP的影响

血清检测指标结果见表3，与假手术组相比，模型组的各项指标均升高，证明大鼠骨密度低下的模型造模成功。与模型组相比，阳性药组与高剂量组的TRAP、BALP和PINP具有显著性差异，显著降低；CTX-1、BGP;OCN虽与模型组比较有所降低，但未见显著性差异。中剂量组的BALP、PINP与模型组比较具有显著性差异（P＜0.05）。低剂量组的所有指标与模型组比较均未见明显差异（P＞0.05）。

表3 药物对大鼠TRAP、BALP、BGP;OCN、CTX-1、PINP的影响Table 3 Effects of drugs on the TRAP、BALP、BGP;OCN、CTX-1 and PINP of rats

3.4 股骨病理学检查

图2为股骨病理学检查结果，显示假手术组骨组织结构连续、完整、粗壮，呈网状分布，占比面积较大，连接间隔内造血组织成分分布较多，脂肪成分分布较少。与假手术组比较，模型组骨小梁富集在股骨干骺段，骨量低，骨组织结构不完整，骨脆性增加，表明骨质疏松造模成功。与模型组比较，阳性药组骨组织成分增加，鹿羊颗粒高剂量组、中剂量组和低剂量组骨小梁稀疏，变细、断裂的程度有所减轻。证明鹿羊颗粒可以有效减轻骨质疏松的程度，但是骨质疏松减轻的程度不同，高剂量组减轻骨质疏松的程度高于中剂量组和低剂量组。

HE染色与茜素红S染色结果见表4，根据评分 标准进行评分[14]。

表4 HE染色与茜素红S染色积分统计Table 4 The HE staining and alizarin red S staining integral statistics

4 讨论与结论

中药防治骨质疏松症机理的研究已成为近年来研究的一个热点[15]，从骨组织水平的研究认为，中药可以通过调节下丘脑、垂体和多个靶腺轴的功能促进肠钙吸收，调节体内微量元素的平衡和改善骨的内部结构等机理防治骨质疏松[16,17]。

在骨形成标志物测定结果中，BALP是骨特异性碱性磷酸酶，是成骨细胞的一种细胞外酶，当骨骼矿化受阻时，成骨细胞合成大量碱性磷酸酶，使血清中BALP明显升高[18]。PINP是I型原胶原N端前肽，是监测骨代谢微小变化最敏感的指标[19]。本实验中去卵巢所致骨质疏松模型大鼠骨密度显著降低，骨代谢标志物PINP水平显著升高，证明骨质疏松症较为严重。BGP;OCN是骨钙素，是骨骼矿化的必需物质，是骨质中最丰富的非胶原蛋白[20]。模型组大鼠血清BGP;OCN水平虽然升高但是没有达到显著水平，可能是因为血清中BGP;OCN显著升高发生在骨质疏松合并发生骨折后[21]，BGP;OCN越高提示骨转换能力越强，将消耗成骨细胞的再生能力[22]，加速成骨细胞的凋亡，成骨细胞越少，骨量丢失越严重，导致骨质疏松也越严重[23]。

在骨吸收标志物血清测定指标中，TRAP是抗酒石酸酸性磷酸酶[24]，模型组血清中TRAP显著增高，是由于去卵巢的大鼠破骨细胞活性增加，骨重建失衡，骨吸收大于骨形成，并且TRAP与骨密度呈显著负相关[25]。CTX-1是Ⅰ型胶原蛋白C末端肽，其水平反映了破骨细胞骨吸收活性，是骨吸收的重要生化标志物[26]。血清中CTX-1指标数值在本实验中未见显著变化，可能是除受骨吸收影响外，还与自身运动和高钠饮食等因素相关[27,28]，虽然大鼠已造成骨质疏松模型，但情况已趋于稳定，所以血清中CTX-1并未有显著性差异[29]。

综上考虑，鹿羊颗粒高剂量与阳性药和模型组相比，具有增加去卵巢大鼠骨矿成分和骨基质的作用，可以减缓骨量流失和减轻骨质疏松的程度，并且在血清测定结果中，鹿羊颗粒具有降低血清中TRAP、BALP和PINP含量的作用。本研究中的鹿羊颗粒为中药复方提取物，未来可以对其增加骨密度的机制进一步研究以及对产品进行多方向研发。