宫颈癌患者杀伤性T细胞中CD39分子表达水平及临床相关性研究

庄俊红

摘要：目的：研究肿瘤患者外周血中淋巴细胞亚群的各项指标及CD39分子表达水平和肿瘤患者临床信息及预后的相关性。方法：选取宫颈癌患者共43例，收集肿瘤患者外周血并用流式細胞术检测和分析外周血中淋巴细胞亚群7项指标及CD39分子表达水平，同时收集肿瘤患者的临床信息，分析两者是否具有相关性。结果：研究发现宫颈癌患者外周血中淋巴细胞亚群7项指标，其中CD8阳性T细胞绝对数及CD4/CD8比值同患者的临床分期、淋巴结转移和远处转移相关;此外在宫颈癌中CD4阳性和CD8阳性T淋巴细胞表面CD39分子的表达水平同患者的临床分期、淋巴结转移和远处转移相关。结论：本研究发现宫颈癌早中期患者外周血中CD8阳性T细胞的数量较晚期患者明显增多，提示肿瘤患者外周血中CD8阳性T细胞的数量同患者的预后相关;此外早中期宫颈癌患者CD4阳性和CD8阳性T细胞表面CD39分子表达水平明显低于晚期患者，提示CD39分子可能同晚期患者CD8阳性T细胞数量减少相关。

关键词：淋巴细胞亚群，流式细胞术，细胞毒性T细胞

Abstract：Objective  The purpose of this study is to investigate the correlation between lymphocyte subsets， CD39 expression level in peripheral blood of tumor patients and their clinical information and prognosis. Methods Initially， We chose 134 patients who have one of the following cancers： lung cancer， cervical cancer， or breast cancer and collected their clinical information and peripheral blood. Furthermore， we detected 7 indicators of lymphocyte subsets and CD39 expression level in their peripheral blood by flow cytometry and analyzed the correlation between those indicator values of each individual and its corresponding clinical information. Results According to our study， correlation did exist between the absolute counts of CD8+ T cells， the ratio of CD4/CD8 and clinical stages， lymph node metastasis， distant metastasis;and also there is correlation between the CD39 expression level and clinical stages， lymph node metastasis， distant metastasis. Conclusion The number of CD8+ T cells in the peripheral blood of patients with cervical cancer in the early and middle stage is significantly higher than that inthe advanced stage， suggesting that the number of CD8+ T cells is associated with the prognosis of patients. In addition， the expression levels of CD39 molecules on the surface of CD4+ and CD8+ T cells in patients with early and middle stage cervical cancer were significantly lower than those in advanced patients， suggesting that CD39 molecules may be related to the decrease in the number of CD8+ T cells in advanced patients

Key Words：lymphocyte subsets， flow cytometry， cytotoxic T cell

【中图分类号】R711.74             【文献标识码】A             【文章编号】2107-2306（2021）12--03

人口的增长和老龄化，以及多种不良生活方式导致癌症患者数量越来越多，全球癌症负担持续增加。癌症的发生、发展与机体的免疫状态密切相关。机体抗肿瘤免疫中免疫细胞起主导作用，能够识别和清除肿瘤细胞。流式淋巴细胞亚群作为一种常规检查，是反映细胞免疫功能的重要指标，在肿瘤免疫监测具有重要意义，进一步为患者的临床治疗方案提供参考依据。代谢组学和免疫学一直是医学生物学的前言领域。已有文献报道在肿瘤免疫微环境中腺苷是一个较为重要的免疫抑制分子，它能够促进调节性T细胞的生成，同时影响免疫微环境中的其他免疫细胞，从而促进肿瘤细胞的逃逸。而CD39作为腺苷代谢途径中的起始分子，在腺苷产生过程中发挥着重要作用。本研究一方面通过分析患者外周血中CD3阳性T淋巴细胞，CD4阳性T淋巴细胞，CD8阳性T淋巴细胞，B淋巴细胞和NK细胞占淋巴细胞的比例及绝对数，并将这些指标相结合，从而评估机体的免疫功能状态;另一方面通过检测T细胞上CD39分子的表达水平，同时结合肿瘤患者的临床信息，进行相关性研究，从而探索腺苷代谢途径的关键分子CD39影响肿瘤患者免疫功能的机制。

1.材料与方法

1.1材料

采集天津市肿瘤医院空港医院放疗科住院患者EDTA抗凝外周血2ml。所有患者采血前均未接受过肿瘤治疗，并且具有完整的临床相关资料。

1.2实验方法

取100ul外周血样本加入流式管中，标记CD3/CD19/CD16+CD56/CD45和CD3/CD4/CD8/CD45抗体（Beckman Coulter公司），室温孵育15分钟，加入500ul溶血素（Beckman Coulter公司），室温静置10分钟，PBS洗涤细胞后上机。流式数据用Kaluza软件（Beckman Coulter公司）进行分析。

1.3统计学方法

应用SPSS statistics 21软件进行统计学分析。当样本数据符合正态分布时，独立样本之间采用t检验或者单因素分析检验的统计学方法;当样本数据不符合正态分布时，样本之间采用非参数t检验和Kruskal-Wallis检验的统计学方法。P<0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1宫颈癌患者外周血淋巴细胞亚群同其临床信息的相关性分析

为了进一步验证我们上述的结论，我们再次收集宫颈癌患者43例，年龄分布25-69岁，病理类型都为鳞癌。根据TNM分期，本研究分别将患者外周血中淋巴细胞亚群的指标与患者临床信息进行分析。

结果显示其中CD3阳性T细胞和CD4阳性T细胞占淋巴细胞百分比和绝对数与患者的所有临床信息都无统计学差异，没有相关性，CD8阳性T细胞占淋巴细胞百分比与患者的临床信息同样无统计学差异。宫颈癌患者外周血中淋巴细胞亚群指标CD8阳性T细胞绝对数及CD4/CD8比值则同宫颈癌患者的临床T分期，淋巴结转移和远处转移相关，如图3表2所示。有淋巴结转移和远处转移的宫颈癌患者其外周血中CD8阳性T细胞的数量较没有淋巴结和远处转移的患者要少（图1A和1C），同时CD4/CD8比值明显升高（图1B和1D）。根据单因素分析我们发现宫颈癌患者外周血中CD4/CD8比值同T分期具有相关性，但是CD8阳性T细胞的绝对数则和T分期无统计学差异（表1）。进一步分析T1-T4期宫颈癌患者外周血中CD8阳性T细胞绝对数和CD4/CD8比值同T分期的相關性，我们发现T4期宫颈癌患者外周血中CD8阳性T细胞数量要少于T3期（如图2E所示，有统计学差异）和T1-T2期（如图2E所示，无统计学意义。猜测由于样本数量不够，导致其没有统计学差异）。而T4期患者的CD4/CD8比值要明显高于T1-3期患者（如图1F所示，均有统计学差异）。因此早中期宫颈癌患者较晚期宫颈癌患者外周血中具有更多的CD8阳性T细胞数量和较低的CD4/CD8比值;而有淋巴结和远处转移的宫颈癌患者外周血中CD8阳性T细胞数量低于无转移的宫颈癌患者，CD4/CD8比值则较高。

通过上述结果，我们证实了宫颈癌患者外周血中CD8阳性T细胞的绝对数与患者的肿瘤进展具有相关性，晚期患者其CD8阳性T细胞较少，自身的免疫功能较弱，更有利于肿瘤发生发展及转移，同时也具有更差的预后。那与CD8阳性T细胞绝对数该指标相关联的指标CD4/CD8比值也能够从另一个侧面反应肺癌患者的免疫功能状态，提示预后。两者相结合从而给临床一个重要的信息，方便患者的后续治疗。肿瘤患者外周血中CD8阳性T细胞的绝对数及其相关联的指标CD4/CD8比值同肿瘤的发生发展和转移相关，同时这两个指标也是肿瘤患者预后的独立因素。外周血中具有较多数量的CD8阳性T细胞（CD4/CD8比值相对较低）的肿瘤患者具有更好的预后。

2.2宫颈癌患者外周血中T淋巴细胞亚群表面CD39分子表达水平同临床信息相关性分析

腺苷作为免疫微环境中重要的负性调控分子，对机体免疫具有一定的调节作用。而CD39分子作为腺苷代谢途径的关键分子是否也对机体免疫具有调节作用？本研究检测了宫颈癌患者外周血中T淋巴细胞表面CD39分子的表达水平，同时与临床信息进行相关性分析。

结果显示CD4和CD8阳性的T细胞表面CD39分子表达水平同同宫颈癌患者的临床T分期，淋巴结转移和远处转移具有相关性，如图2所示。不管CD4阳性T细胞还是CD8阳性T细胞表面CD39分子表达水平在有淋巴结转移和远处转移患者要明显高于没有淋巴结转移和远处转移的患者。此外CD39分子表达水平也同宫颈癌T分期相关，在T4期表达水平最高，在T1期表达水平最低。因此得出结论早中期宫颈癌患者T淋巴细胞表面CD39分子表达水平要明显低于晚期宫颈癌患者。

图2宫颈癌患者外周血中T淋巴细胞表达CD39分子表达水平同T分期、淋巴结转移及远处转移的相关性

A. CD4阳性T细胞表面CD39分子表达水平同淋巴结转移的相关性;B. CD8阳性T细胞表面CD39分子表达水平同淋巴结转移的相关性;C. CD4阳性T细胞表面CD39分子表达水平同远处转移的相关性;D.CD8阳性T细胞表面CD39分子表达水平同远处转移的相关性;E. CD4阳性T细胞表面CD39分子表达水平同临床T分期的相关性;F. CD8阳性T细胞表面CD39分子表达水平同临床T分期的相关性

结合前面的结论，我们发现晚期宫颈癌患者的由于CD8阳性T细胞数量的减少，从而导致肿瘤的转移进展，进而引起预后不佳。而晚期宫颈癌患者其T淋巴细胞表面CD39分子表达水平要明显高于早中期患者。提示CD39分子表达水平与CD8阳性T细胞数量具有负相关性。作为免疫负调控因子腺苷代谢途径的关键分子，CD39也具有负调控性能，能通过某些分子机制引发CD8阳性T细胞的耗竭，从而减少CD8阳性T细胞的数量，最终使得肿瘤细胞转移进展。结合已有的文献报道，本研究通过分析宫颈癌患者不同时期T淋巴细胞绝对数及其表面负性调控分子CD39表达水平，提出及证实了CD39分子同CD8阳性T淋巴细胞的功能具有负相关性。我们也将继续对其具体分子机制进行研究探索。

3.讨论

免疫系统是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统，具有监视、防御和调控的作用。如何使机体有效识别肿瘤细胞并对其进行清除是肿瘤治疗的核心问题之一。淋巴细胞作为主要的免疫细胞，在免疫系统发挥功能的过程中起重要作用。淋巴细胞包括辅助性T细胞，记忆型T细胞，调节性T细胞等等。因此我们通过流式细胞术检测肿瘤患者外周血中CD3阳性T细胞，CD4阳性T细胞，CD8阳性T细胞，B淋巴细胞和NK细胞来评估肿瘤患者的一个免疫功能状态，从而为临床提供有用的信息。T淋巴细胞介导的细胞免疫是机体主动的免疫应答，T淋巴细胞具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞、辅助B细胞产生抗体以及产生细胞因子等。而CD8阳性T细胞是细胞毒性T细胞，能够直接杀伤靶细胞。因为本研究检测和分析T淋巴细胞及其亚群同临床的相关性。结果显示肿瘤患者外周血中同细胞毒性T细胞相关的两个指标CD8阳性T细胞绝对数和CD4/CD8比值同肿瘤患者的临床信息相关，早中期肿瘤患者外周血中细胞毒性T细胞数量要高于晚期患者，提示细胞毒性T细胞的數量与肿瘤患者的预后相关。肿瘤患者外周血中具有较多数量的细胞毒性T细胞，其具有更好的预后。本研究很好的诠释了细胞毒性T细胞作为机体免疫系统杀伤肿瘤细胞的主要执行者，只有这类淋巴细胞基数达到一定数量时，机体的免疫系统才有可能去杀伤肿瘤细胞;而如果这类细胞的数量基数都很低，机体的免疫系统就无法去杀伤肿瘤细胞，从而影响后续的治疗包括一些免疫单抗治疗，如PD-1，CTLA-4等。外周血淋巴细胞亚群虽然不能够准确反应肿瘤原位中淋巴细胞亚群的状态，但是外周血样本取材方便，检测准确的特点，同时同一患者外周血和肿瘤原位淋巴细胞亚群变化具有一致性，使得外周血淋巴细胞亚群分析成为目前最为可行的评估肿瘤患者免疫状态。

已有研究报道CD39分子的表达能够鉴别CD8+ T细胞是否耗竭，同时其他研究也证实了CD39和PD-1分子能够共表达与T淋巴细胞表面。而CD39分子能够诱导调节性T细胞转化和生成。结合本研究的发现，我们可以大胆的猜测，作为负性调控分子的CD39，其表达于CD8阳性T细胞的表面，能够通过某些信号通路，进而引发CD8阳性T细胞的耗竭，使得CD8阳性T细胞的数量减少。此外，CD39的表达还可通过某些信号通路进一步引发T细胞一些免疫检查点的表达，比如PD-1，进一步发挥其负向免疫调控作用。

通过本研究，我们发现肿瘤患者外周血中CD8阳性T细胞的绝对数同患者的临床分期，淋巴结转移和远处转移相关，提示可能是肿瘤患者预后的独立因素之一。肿瘤患者外周血中CD8阳性T细胞的数量越多，患者具有更好的预后。我们希望通过检测肿瘤患者外周血中淋巴细胞亚群，为临床提供有价值的信息，进而使临床能够根据每个患者的免疫功能状态制订个体化的治疗策略，也使每个患者能够从各项检测中得到最优化的获益。此外本研究还发现了CD39分子表达水平同CD8阳性T细胞数量具有负相关性，为后续阐明CD39分子负向调控分子机制提供了基础。

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