血小板颗粒释放机制及其对标本检验前变异影响研究进展

张式鸿， 房邦仁， 叶曼曼， 邓冠华

（1.中山大学附属第一医院检验科，广东 广州 510080；2.广州阳普医疗科技股份有限公司广东省医用材料血液相容性研究企业重点实验室，广东 广州 510530）

血液标本检验前变异是临床医学检验需要加以注意并控制的重要环节。导致血液标本检验前变异因素有很多，其中血小板活化及其内容物释放对血液标本的检测影响很大，一方面可改变血清与血浆成分，另一方面可通过对血细胞代谢的影响，进一步改变血清、血浆及血细胞原始状态，最终影响检验结果。了解血小板释放机制、调节因素及影响因素，能为正确处理标本提供理论依据，指导检验人员尽可能在检验前维持标本的原始状态，最大限度地减少检验前变异，提升检验结果的准确性。本文对血小板释放的机制和调节因素及其与标本检验前变异的关系进行综述。

1 血小板释放的物质基础

血小板直径为1～3 μm，是血液中体积最小的血细胞，对生理止血、维持毛细血管通透性、完整性及促进凝血等功能的发挥至关重要。血小板能执行这些功能的关键在于血小板释放，而胞质内含有的α颗粒、致密颗粒、溶酶体颗粒是促进血小板释放的物质基础[1]。

血小板胞质内含有的3种颗粒中，α颗粒含量最多、体积最大[1]。通过透射电镜中可观察到α颗粒结构从外向内依次是：颗粒外膜、管道支持结构、低电子密度区和高电子密度类核区。致密颗粒是血小板中含量第二丰富、体积最小的颗粒，每个血小板有3～8个致密颗粒，直径约为150 nm[2]。溶酶体颗粒体积比α颗粒小，在人体血小板中含量非常低，结构和内容物一般是由单层膜包被的圆形颗粒[3]。

2 血小板释放的机制

血小板释放的具体机制仍在探索之中，较被认可的说法是1993年SÖLLNER等[4]在研究神经递质分泌机制过程中提出的膜融合假说，该假说主要由膜融合“引擎”——可溶性N-乙基-马来酰亚胺敏感因子结合蛋白受体（soluble N-ethylmaleimide-sensitive attachment protein receptor，SNARE）蛋白介导。但还需其他分子如Sec1/Munc18（SM）蛋白、N-乙基-马来酰亚胺敏感融合蛋白（N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein，NSF）和可溶性NSF接触蛋白（soluble NSF attachment protein，SNAP）的协助才能完成膜融合[4]。SNARE是小分子膜结合蛋白超家族成员，根据功能不同可分为囊泡膜SNARE和靶膜SNARE。单体囊泡膜SNARE与靶膜SNARE结构上是未折叠的，虽也能自发结合，但这种结合不稳定，需SM蛋白协助才能形成稳定“拉链状”三联复合体，称为Trans-SNARE复合体或SNAREpin。该复合体释放的大量能量足以克服膜之间的能量和水合力量，实现膜靶向接触并发生融合，然后三联复合体在NSF、SNAP的帮助下发生结构变化，形成Sis-SNARE复合体并很快解体，SNARE重新投入下一个循环。

有研究表明，SNARE介导膜融合机制也是血小板颗粒释放的主要机制，并与神经递质分泌过程有许多相似之处，如分泌机制的启动信号均为细胞内钙离子浓度升高，细胞内囊泡或颗粒均通过依赖SNARE途径被“分泌”至细胞膜外[5]。血小板中囊泡膜SNARE包括囊泡相关膜蛋白（vesicle-associated membrane protein，VAMP）-2、VAMP-3、VAMP-7和VAMP-8，靶膜SNARE包括syntaxin-2、syntaxin-4、syntaxin-6、syntaxin-7、syntaxin-11、syntaxin-12、syntaxin-16、syntaxin-17和syntaxin-18[6-8]。KOSEOGLU等[9]发现，VAMP-7主要分布在扩张血小板外围，而VAMP-8主要集中在血小板颗粒区。BANERJEE等[10]的研究表明，VAMP-3在α颗粒内吞途径中发挥重要作用，而在血小板胞吐作用中发挥的作用较小。FENG等[11]在体外利用针对VAMP家族、syntaxin-2、SNAP-23单抗也证明SNARE是血小板颗粒分泌途径中必不可少的因素。GOLEBIEWSKA等[12]在研究血小板膜融合时发现，syntaxin-8缺失与致密颗粒胞吐作用缺陷有关。

3 血小板释放的调节因素

血小板释放受多个环节调节，起主导作用的是膜融合和活化。其中膜融合环节中主要是SM蛋白、Rab蛋白、细胞骨架和膜成分等发挥主要作用，而血小板表面膜受体、信号通路相关分子、钙结合类蛋白在活化环节中占主导作用。

3.1 膜融合环节对血小板释放的调节

3.1.1 SM蛋白的调节 CARDENAS等[13]在研究SM蛋白在血小板分泌中作用时发现，缺乏Munc18-1和Munc18-3对血小板胞吐作用没有影响，但Munc18-2缺乏则可完全抑制α颗粒、致密颗粒、溶酶体颗粒释放，并削弱血小板聚集和体外血栓形成。

3.1.2 Rab蛋白的调节 目前在人体血小板中发现超过40个Rab蛋白成员[14]，主要通过影响膜融合而调节血小板活化及分泌；JALAGADUGULA等[15]的研究结果显示，因转录因子RUNX1缺失而导致Rab1B下调会改变内质网到高尔基复合体早期囊泡运输，最终导致α颗粒中血管性血友病因子含量降低。

3.1.3 细胞骨架的调节 与微丝或微管相关类蛋白在血小板内颗粒物、囊泡释放或靶向运输等过程中发挥非常重要作用，这类蛋白主要包括微管蛋白、肌动蛋白[16-17]等。BEGLEY[16]采用紫杉醇和拉春库林A分别阻断凝血酶和惊厥毒素诱导血小板中二磷酸腺苷-核糖基化因子6（adenosine diphosphate-ribosylation factor 6，ARF6）活化后，发现微管分解和肌动蛋白组装在血小板激活关键信号因子ARF6的激活中发挥重要作用。GE等[17]的研究表明，细胞骨架F-肌动蛋白通过物理屏障作用来调节血小板致密体分泌。

3.1.4 膜成分的调节 磷脂酸等脂膜成分和脂膜代谢产物在S N A R E介导膜融合过程发挥重要作用，但其中脂膜结构变化的机制尚不清楚[18-19]。ZHUKOVSKY等[20]的研究结果显示，磷脂酸是膜融合过程中酶活化生成的脂质底物，且通过生成负膜曲率、与膜融合所需相关蛋白的相互作用和激活与膜重排相关的酶等机制来影响膜融合。

3.2 活化环节对血小板释放的调节

3.2.1 血小板表面膜受体的调节 根据功能不同，血小板表面膜受体主要分为活化受体和黏附受体，前者典型代表有血栓素受体、二磷酸腺苷受体和凝血酶受体，后者主要以胶原受体、糖蛋白（glycoprotein，GP）Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ复合体为代表。有研究表明，血小板膜受体并不均匀分布于膜上，而是常聚集于表面的一些被称为“脂质筏”的微小结构域[21]。任何受体结构或功能异常均可导致血小板对刺激信号不应答或应答不足从而影响释放。巨大血小板综合征[22]是一种先天性出血性疾病，其根本原因是血小板表面GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合体缺失或功能障碍导致血小板聚集功能障碍，致使血小板无法对相应刺激信号，如血管性血友病因子和凝血酶作出有效反应。

3.2.2 信号通路相关分子的调节 Ca2+、蛋白激酶C、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸、肌醇三磷酸等[23-24]信号分子在血小板分泌中发挥信号传递作用，如这些信号分子工作异常，信号传递通路可被阻断进而影响血小板功能或行为。

3.2.3 钙结合类蛋白的调节 血小板释放会促进血小板内钙离子浓度升高，同样细胞内钙离子浓度上升也会促进血小板分泌颗粒物，钙结合类蛋白通过调节细胞内钙水平来控制血小板分泌[25]。

4 血小板释放对标本检验前变异的影响

平均血小板体积是临床上广泛应用的血常规指标，常用于反映血小板体积大小、预测凝血活性和血小板活化。有研究表明，血小板聚集增强和黏附分子表达增加可增大其活力和体积并使其释放更多的血栓素A2和β血小板球蛋白[26]。外界环境某些刺激可能改变离体血小板形态、体积，并使其活化和释放，而后可能对标本检验前变异造成影响[27-28]。另外，外部剪切力是影响血小板聚集和活化因素之一。LEE等[29]的研究表明，在更大剪切力作用下胶原表面血小板聚集更显著。DENG等[30]的研究表明，高剪切力作用下血小板激活需通过细胞内信号级联反应来实现。RAHMAN等[31]的研究结果显示，增大上游剪切力可增强下游血小板活化程度；另外，温度也会影响血小板的活化和分泌。HORIOK等[32]用-20 ℃低温处理小鼠后，发现低温可激活脾脏中的血小板，并使其释放颗粒中的血小板第4因子（platelet factor 4，PF4）和前血小板碱性蛋白。WOOD等[33]的研究表明，低温存储后血小板表面膜糖蛋白（GPⅠb、GPⅨ、GPⅡb和GPⅣ）表达会下降，而血小板活化标志物PF4、P-选择素表达会增加。JOHNSON等[34]的研究表明，与室温储存的血小板相比，低温和冷藏保存的血小板中微颗粒含量明显升高，且凝血酶生成速度更快。此外，标本储存容器及添加物也会致使血小板活化，并影响其释放血小板源性微颗粒、可溶性P-选择素、血小板反应蛋白（thrombospondin，TSP）。MUSSBACHER等[35]在常温下采用不同抗凝剂（[柠檬酸-茶碱-腺苷-双嘧达莫（citrate-theophylline-adenosinedipyridamole，CTAD）、酸柠檬酸-右旋糖（acid-citrate-dextrose，ACD）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、柠檬酸盐、肝素）抗凝并分离血浆，监测血小板中储存因子，结果显示CTAD和ACD抗凝血浆标本常温储存6 h内，其PF4和TSP-1含量最低、变化最小；他们还发现在4 ℃条件下制备的血浆标本中，CTAD抗凝标本中PF4和TSP-1含量在24 h内最稳定。MANNUß等[36]在研究EDTA、柠檬酸钠、硫酸镁抗凝效果时发现，在相同血小板体积范围内，EDTA抗凝血浆标本中血小板活化产物P-选择素表达最高。吕明恩等[37]研究原发性血小板减少症出血患者出血风险与血小板活化相关性时，发现血小板活化前、后α颗粒分泌的P-选择素的表达和比值与血小板计数显著相关。

5 小结与展望

综上所述，血小板释放反应在血小板参与的各种反应中占重要地位。体内许多因素，如炎症、肺部疾病、心肌梗死等能导致血小板异常激活而释放颗粒内容物，使血浆环境里物质种类和浓度发生变化，物质代谢、信号通路等受到干扰，导致机体止凝血功能改变，并产生相应的临床症状。体外由于储血材料的介入，血小板激活释放过程更复杂。这就意味着，实验室获得的看似稳定的血清或血浆标本实际上可能并不稳定，这样的标本将无法保证检测项目的准确性和重复性。

未来的研究如能详细阐明血小板释放内容物在血浆中的代谢机制及其与其他细胞或可溶性物质发生反应的机制，并建立准确评价血小板释放的方法和体系，将能为临床实验室提供控制检验前变异因素的理论依据，为生物医用材料血液相容性研究提供新思路，也能为制药工程研究提供新方向。