外泌体在肾脏疾病中的研究进展

何星，王富博，叶华茂

外泌体是一种大小为40～160 nm的细胞外囊泡，包含有多种诸如核酸、蛋白质、脂类、氨基酸、小分子代谢物等内容物，这些内容物可以反映其细胞来源。此外，外泌体还可以将内容物转运到靶细胞，成为细胞与细胞之间信息传递的重要媒介。外泌体在体液中广泛存在。有研究通过分析肾单位不同节段的外泌体成分及其与肾脏生理和病理生理的相关性，验证了与肾脏疾病相关的来自血清、肾小管细胞、肾实质细胞、肾小球内皮细胞、间充质干细胞、泌尿系统干细胞、癌细胞和巨噬细胞的外泌体的来源与作用[1-2]，说明外泌体广泛参与了多种肾脏疾病的发生与发展。本文就外泌体在肾脏生理学和肾脏疾病的分子机制、诊断和治疗中的作用等方面进行综述。

1 外泌体在肾脏生理学中的作用

肾脏是维持内环境稳态的重要器官之一。外泌体在肾单位细胞间通讯中发挥着重要作用[2]。蛋白质组学研究表明，肾单位中的外泌体主要来自位于近曲小管、髓攀升支粗段、远曲小管和集合管的肾小球足细胞和肾小管细胞。不仅如此，尿液外泌体中富含的多种蛋白质和转运蛋白均来自于肾单位中的细胞。例如，来自肾小球足细胞的足糖萼蛋白、来自近曲小管的水通道蛋白(aquaporin，AQP)-1、来自髓袢升支粗段的2型Na+-K+-2Cl-同向转运体、来自远曲小管的Na+-Cl-同向转运体以及来自集合管的AQP-2蛋白[3]。这些研究表明，肾单位中的外泌体来源于肾单位中的不同细胞，而且包含有这些细胞中的重要信息分子。

研究发现，集合管细胞在血管加压素类似物作用下，其外泌体中AQP-2表达升高，从而诱导邻近细胞上调AQP-2的表达以增强水的重吸收[4]。Gildea等[5]研究发现，肾小球足细胞的外泌体可沿近曲小管将信息传递至远曲小管上皮细胞。用非诺多泮(多巴胺受体激动剂)处理近曲小管细胞后产生的外泌体可以转移到远曲小管和集合管，并进一步调节该部位细胞活性氧的产生。因此，在肾脏生理中，外泌体作为细胞间传递信息的媒介，可以将生物活性分子从近端肾小管细胞传递到远端小管细胞并发挥激活效应细胞的作用。

2 外泌体与肾脏疾病

外泌体在肾脏疾病的发生和发展中起着重要作用，对于外泌体的研究不仅能够进一步阐述肾脏疾病的分子机制，还能为肾脏疾病的分子诊断、预后判断和治疗提供新的思路和方法。

2.1 外泌体在急性肾脏损伤中的研究进展 急性肾脏损伤机体的尿液外泌体中含有相关致病分子、生物标志物和治疗因子。对急性肾脏损伤致病机理和生物标志物的研究发现，缺血再灌注诱导的急性肾脏损伤可降低大鼠尿液外泌体中AQP-1、AQP-2的mRNA表达水平。AQP表达水平的降低可能会影响肾单位中水的重吸收，并与急性肾脏损伤的病程进展相关[6]。另外，大鼠的尿液外泌体miRNAs可用于判断缺血再灌注诱导的急性肾脏损伤的病程进展。该研究发现，在早期损伤阶段可检测到外泌体miR-16、miR-24和miR-200c水平升高，而在晚期纤维化阶段则发现miR-125和miR-351水平升高[7]。Sonoda等[8]发现顺铂诱导的急性肾脏损伤小鼠模型的尿液外泌体中胎球蛋白A水平升高，但AQP-2水平降低。这些研究表明，尿液外泌体中相关信号分子可用于急性肾脏损伤的分子诊断和预后判断。

间充质干细胞来源的外泌体具有治疗效果，能够减轻急性肾脏损伤的病变程度。通过给予人脐带Wharton′s jelly来源的间充质干细胞分泌的外泌体可减轻大鼠缺血再灌注引起的急性肾损伤并改善肾功能[9]。间充质干细胞外泌体C-C模体趋化因子受体2(C-C motif chemokine receptor-2，CCR2)含量增高并能够降低其配体——CCL2的水平，从而抑制后者在小鼠缺血再灌注诱导的急性肾脏损伤中诱导巨噬细胞浸润的作用[10]。骨髓间充质干细胞来源的外泌体富含miR-199a-3p，可以通过增加miR-199a-3p在肾细胞中的表达水平从而预防缺血再灌注诱导的急性肾脏损伤。此外，向大鼠静脉注射肾小管细胞外泌体可以改善局部缺血诱导的肾损伤[11]。这些研究表明，间充质干细胞或肾脏细胞来源的外泌体可能改善肾损伤的预后，这为急性肾损伤的预防和治疗提供了新的方法。

2.2 外泌体在肾移植排斥反应中的研究进展 目前，肾脏活检是诊断肾移植排斥反应的金标准。然而，这种有创诊断技术常常会造成血尿等诸多活检相关并发症。外泌体中潜在的生物标志物或可更便捷地诊断细胞和抗体介导的同种异体移植反应。T细胞浸润是诊断肾移植后急性细胞排斥反应的标志之一。发生急性细胞排斥反应的患者尿液的外泌体中检测到CD3强阳性，这可能提示肾同种异体移植中T细胞的浸润[12]。对于抗体介导的排斥反应，在同种异体移植排斥反应患者的血浆外泌体中发现糖蛋白130(glycoprotein 130，gp130)、CCL4、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis fact￣or，TNF-α)、含SH2结构域蛋白1B (SH2 domain containing 1B，SH2D1B)、小窝蛋白1(caveolin 1，CAV1)和非典型趋化因子受体1的mRNA水平升高[13]。

外泌体有助于揭示肾脏移植后的病理变化。有学者发现，宿主在接受肾移植后出现蛋白尿，其尿液外泌体γ上皮钠离子通道(epithelial sodium channel，ENaC)的50 kDa和75kDa亚基含量升高，并与出现的高血压有相关性[14]。此外，有患者肾脏移植后第1天尿液外泌体AQP-2含量下降，伴有尿量增加和尿渗透压降低，但尿液外泌体AQP-2含量在移植后第6天恢复，这提示肾移植后AQP-2的一过性下降和肾小管水重吸收功能受损可能是导致移植后的急性利尿反应的重要原因[15]。

外泌体还可用于监测免疫抑制药物的毒性。在使用环孢素-A的肾移植患者中发现尿液外泌体Na+-K+-2Cl-同向转运蛋白增加，合并高血压的肾脏移植患者接受他克莫司治疗后，尿液外泌体Na+-Cl-同向转运蛋白的含量也出现升高[16]。这2种转运蛋白含量的升高均与高血压相关，而高血压是肾脏移植后免疫抑制治疗期间的常见并发症。

总体而言，外泌体含有众多的分子标志物与肾脏移植相关。移植后早期对外泌体的检测可能有助于临床医生更好地判断异体移植肾的功能状态。

2.3 外泌体在肾细胞癌中的研究进展 外泌体为肾细胞癌的早期诊断和预后判断提供重要的线索。蛋白质组学研究发现，肾细胞癌患者尿液外泌体基质金属蛋白酶9、血浆铜蓝蛋白、足糖萼蛋白、阻黑体4(dickkopf-related protein 4，DKK4)和碳酸酐酶IX增加，而AQP-1、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、中性溶酶、二肽酶-1和多配体聚糖结合蛋白1减少[17]。Butz等[18]发现与正常人相比，肾透明细胞癌患者尿液外泌体miR-126-3p与miR-449a或miR-34b-5p同时升高。与肾脏良性占位病变相比，肾透明细胞癌患者尿液外泌体miR-126-3p与miR-486-5p同时升高。此外，临床研究表明，血清外泌体miR-224和miR-210可以作为诊断肾透明细胞癌生物标志物[19]。因此，体液外泌体有望作为一种良好的肾细胞癌的早期诊断和预后判断的分子标志物，可对患者进行无创、实时、可重复的监测。

另外，外泌体在肾细胞癌的进展中也发挥着重要的作用。一项体外实验发现，肾透明细胞癌患者原代细胞和肾细胞癌细胞系外泌体转化生长因子(transforming growth factor,TGF)β1水平升高，进而导致自然杀伤细胞功能障碍[20]。Wang等[21]发现患者的肿瘤干细胞外泌体能促进肾透明细胞癌的增殖和上皮间质转化，CD103阳性的外泌体可作为转移性肾透明细胞癌的生物标志物。肾细胞癌细胞外泌体与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL)-12共同刺激的CD8+T细胞具有自体抗癌效应[22]。

2.4 外泌体在肾脏结石病中的研究进展 肾结石的形成不仅与尿液晶体过饱和相关，还与尿液晶体、蛋白质、外泌体、胶原纤维和细胞之间的相互作用有关。结石附着部位的肾乳头组织在电镜下可见许多有核磷酸钙晶体的外泌体生长。

炎症状态中巨噬细胞等相关细胞的富集有助于形成结石基质。有研究检测了巨噬细胞在钙盐处理后其外泌体中蛋白组学的变化，并进行了蛋白功能测定，结果发现，巨噬细胞外泌体中参与免疫调节(如参与T细胞活化、内环境稳态和细胞迁移等)的蛋白质含量出现改变；ELISA结果显示，巨噬细胞外泌体IL-1β(炎症小体活化的标志)含量增加。进一步的功能测定结果显示，钙盐处理后外泌体增加了巨噬细胞的吞噬活性。为进一步分析蛋白质组的变化与免疫功能的关系，作者发现通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制波形蛋白(外泌体中含量明显升高的一种蛋白)的表达可以消除巨噬细胞外泌体对单核细胞、T细胞迁移和巨噬细胞吞噬活性的影响，这进一步证实了外泌体波形蛋白能够参与免疫细胞募集和增强巨噬细胞吞噬活性[23]。另有研究发现，巨噬细胞经钙处理后产生的外泌体中有26种蛋白质含量发生改变，而未经钙处理的巨噬细胞外泌体则无此改变。这些发生改变的蛋白质主要参与细胞骨架和肌动蛋白结合、钙结合、应激反应、转录调节、免疫应答和细胞外基质降解。进一步的功能测定结果发现，巨噬细胞经钙处理后产生的外泌体使肾小管细胞过表达IL-8并促进中性粒细胞迁移。此外，巨噬细胞经钙处理后产生的外泌体更容易释放出内容物以激活炎症，这些外泌体能紧密结合钙盐结晶，随后在细胞外基质不断累积[24]。这些发现表明，巨噬细胞外泌体在多方面参与了肾小管细胞的炎症级联反应，从而促进肾结石的形成。

2.5 外泌体在狼疮性肾炎和其他肾小球疾病中的研究进展 尿液外泌体检查是一种无创的生物标志物检查方法，可以用于多种肾小球疾病的严重程度和疾病预后的评估。狼疮性肾炎小鼠模型实验发现，随着肾小球损伤的进行性加重，miR-26a在尿液外泌体中的含量也逐渐增加并通过调节足细胞分化而维持细胞骨架完整性。因此，其有望成为肾小球肾炎中足细胞受损的标志物[25]。炎性miRNA(如let-7a和miR-21)在狼疮性肾炎患者的尿液外泌体中含量降低，故可作为狼疮性肾炎临床分期的一项指标[26]。和正常人相比，活动性狼疮性肾炎IV类患者尿液外泌体miR-3135b升高，而miR-654-5p仅在形成新月体的狼疮性肾炎IV类患者中升高[27]。

此外，外泌体mRNA和miRNA也是肾小球疾病的重要检测指标。例如，局灶性节段性肾小球硬化症患儿尿液外泌体miR-193a含量高于肾病综合征患儿[28]。IgA肾病患者尿液外泌体中CCL2的mRNA水平升高，并且与疾病活动性相关[29]。此外，有报道称特发性肾病综合征患儿的尿液外泌体中有30种miRNAs含量明显增加，其中miR-194-5p、miR-23b-3p含量与尿蛋白水平具有较明显的相关性[30]。因此，通过对尿液外泌体中相关分子分析或可进一步确定肾小球疾病诊断和预后的分子标志物。

2.6 外泌体在慢性肾脏病中的研究进展 外泌体在糖尿病肾病和肾纤维化等慢性肾脏病的疾病发生发展过程中发挥着重要作用。研究表明，1型糖尿病肾病与尿液外泌体中纤溶酶、前列腺素和尿激酶的增加相关，同时也与ENaC的蛋白水解有关，这可能导致钠潴留和高血压[31]。高糖条件培养的肾小球内皮细胞产生的外泌体能够促进糖尿病肾病肾小球系膜细胞和足细胞的上皮间质转化和纤维化，高血糖促进巨噬细胞外泌体的分泌，继而引起肾小球系膜增生并激活肾组织炎症级联反应，敲除TGF-β1后可以减弱该种作用，这表明TGF-β1可能是巨噬细胞与肾细胞之间相互作用的重要媒介[32]。一项蛋白质组学研究将糖尿病肾病患者与正常人的尿液外泌体进行了比较，结果显示糖尿病肾病患者尿液外泌体双库尼茨抑制剂前体和组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶升高，而电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1降低，这可能有助于糖尿病肾病诊断和病情监测。糖尿病肾病患者尿液外泌体中也检测到AQP-2和AQP-5升高，表明这些蛋白可以作为诊断糖尿病肾病生物标志物[33]。miRNA微阵列转录组学研究发现与2型糖尿病患者和正常人对比，2型糖尿病肾病患者尿液外泌体中共检测到16种miRNA含量异常。其中大部分miRNA仅在出现微量白蛋白尿的糖尿病肾病患者中能检测到，通过qRT-PCR证明miR-320c和miR-6068与尿白蛋白排泄率具有明显的相关性。同时发现miR-320c可能通过作用于血小板反应蛋白-1而影响TGF-β信号通路，因而其有望作为2型糖尿病肾病病情监测的生物标志物[34]。因此，这些指标或可作为诊断2型糖尿病肾病的生物标志物。

研究发现慢性肾脏病患者的尿液外泌体miR-29c和miR-181a降低，并与疾病病程或肾纤维化相关[35]。Jiang等[36]发现骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过调节细胞间粘附分子-1的表达来抑制树突状细胞向肾脏的浸润，该外泌体还能抑制肾纤维化并降低促炎细胞因子(TNF-α和TGF-β1)的水平，此外，来自泌尿系统干细胞的外泌体含有生长因子、TGF-β1、血管生成素和骨形态发生蛋白-7，它们可能在糖尿病肾病的早期参与血管再生和细胞增殖。这些研究表明，利用外泌体有望对糖尿病肾病和肾纤维化等慢性肾脏病进行治疗干预。

3 结论与展望

随着研究的深入，外泌体必将会在肾脏疾病的诊断和治疗方面发挥越来越重要的作用。与常规的生物标志物相比，外泌体富含核酸、蛋白质、氨基酸、脂类、代谢产物等特定的生物标志物，其可从分子水平反映肾脏疾病的遗传、代谢等病理生物学信息，有助于肾脏疾病的特异性诊断；外泌体内生物标志物含量及分布稳定，测量的可重复性强，有助于对肾脏疾病进行无创、实时、可重复的监测；外泌体内分子的动态变化亦可反映肾脏疾病的发展和转归，能够为肾脏疾病的预后提供良好的标志物。虽然外泌体在疾病治疗方面显现出了诸多优势，但外泌体目前并没有在肾脏疾病有实质性的临床应用，后续仍需进行大量的基础研究和临床试验。

目前对于外泌体在肾脏疾病中的应用也面临着各种挑战。首先，由于某些成分(例如高密度脂蛋白、乳糜微粒和微囊泡)的大小与外泌体相近，因此分离或纯化外泌体仍具有挑战性。其次，用于肾脏疾病“液体活检”的外泌体，其来源复杂，如何分离和鉴定出特定疾病来源的外泌体，提高其诊断的特异性仍然是目前亟待解决的问题。最后，外泌体在各种肾脏疾病发生和发展中的分子机制仍需进一步阐明。