miRNA 在青少年特发性脊柱侧凸发病机制中的意义研究进展

刘书中 姚思远 李政垚 李子全 王牧川 牛潼 高晨郜 王以朋

青少年特发性脊柱侧凸 ( adolescent idiopathic scoliosis，AIS ) 是一种青少年中最为常见的脊柱三维畸形，其整体发病率约为 1.5%～3.0%，是一种包括冠状面侧凸、矢状面失平衡和在横轴位上椎体旋转在内的复杂脊柱三维畸形[1-3]。AIS 常发生于青春发育期前后，其发病及进展与基因变异、细胞及机体代谢、相关蛋白表达及脊柱生物力学特性等因素密切相关，其病因学至今尚未被完全阐明[4-5]。目前，关于 AIS 病因及发病机制的研究逐步开展，从最初的动物实验到人体组织学研究，从检测激素水平、骨量测定到近年来开展的基因连锁分析和关联分析，已经取得了一定的研究成果，但截至目前，针对 AIS 发病机制的研究结果与结论并不一致，故仍难以完全合理地解释 AIS 的病因及发病机制[4-5]。因此，进一步深入探索 AIS的病因学及发病机制具有极为重要的意义。

一、miRNA 在 AIS 发病机制中的研究基础

非编码 RNA ( 微小 RNA、长链非编码 RNA，环状RNA ) 的水平可以在体内某些特定生理条件下发生特异性变化，可作为生物标志物对多种疾病的发生、发展起到预测作用。近年来，微小 RNA ( microRNA，miRNA ) 已被多项研究证实在某些疾病的进程中扮演着重要角色，并具备其独特的疾病预测性能[6]。首先，miRNA 来源广泛、易获取，可从血液、尿液、唾液、泪液或精液等人体分泌物中收集，有望成为一种便捷的非侵入性筛检手段[7-10]。其次，由于在循环血液中 miRNAs 通常被包裹在脂质颗粒中，并与保护性蛋白质相结合，这一特性使得 miRNA 可在体循环状态中及体外状态下稳定存在，不同采集、储存、处理、分离等条件下均可保持良好的稳定性[11]。有学者证实，循环中的 miRNA 与其它种类循环核酸相比，在血浆和细胞培养基中均更加稳定[12]。再次，研究表明在疾病的早期阶段即可以检测到特异性 miRNAs 的水平异常，并且大多数 miRNAs 在细胞内和细胞外的含量具有良好的相关性[13]。此外，研究证实 miRNA 检测在筛检、诊断、预测疾病方面具有较高的敏感性和特异性[14-15]。

近年来，包括 miRNA 在内的非编码 RNA ( non-coding RNA，ncRNA ) 的异常表达与多种疾病的发生、发展、分级分期、预后等密切相关，参与了多种细胞重要生物学行为的调控，其与 AIS 疾病的关系也逐渐被揭示，越来越多的研究表明 miRNA 在 AIS 疾病发生、发展过程中发挥着极为关键的作用[1,16-17]。此外，由于大多数 ncRNA 是由细胞分泌的，组织细胞中的 ncRNA 与外周血中的 ncRNA 具有相同的改变趋势，获取组织或外周血中 ncRNA 所致创伤小，这些特点使 ncRNA 有望成为 AIS 疾病早期诊断、病情监测及合理治疗的新型生化指标，并已得到初步研究验证[17-18]。多项研究已表明 miRNA 可通过干预 PTEN / AKT、SMAD3、GAS1 / Akt、RhoC-Akt 等信号转导通路调节椎间盘纤维环细胞的成骨分化、髓核细胞的增殖、细胞外基质降解等多种生物学行为[1-3]。Chen 等[19]对维生素 A 缺乏( vitamin A deficiency，VAD ) 后大鼠胚胎 ( 妊娠第 9 日 ) 的ncRNA 表达谱进行测序 qRT-PCR 检测所选 mRNAs、长链ncRNAs、环状 RNA ( circRNAs ) 和 miRNAs 的表达水平，结果显示两组共检测到 749 种 mRNAs、56 种 miRNAs、685 种长链 ncRNAs 和 70 种 circRNAs 表达水平存在显著差异，Wnt、PI3K-ATK、FoxO、EGFR 和 mTOR 是脊柱侧凸发生过程中的重要途径。Chen 等[20]进一步研究了一种特殊的长链 ncRNA ( SULT1C2A ) 在维生素 A 缺乏诱导的侧凸大鼠模型中的作用和机制，研究发现 SULT1C2A 可通过 PI3K-ATK 信号途径负性调节 VAD-侧凸大鼠模型中rno-miR-466c-5p 的表达，从而增强 Foxo4 的表达，SULT1C2A 可能是脊柱侧凸发生、发展的潜在靶点。

miRNA 对应基因已被实验性地从多种生物中鉴定出来，并且在其它物种中亦存在同源基因，物种间 miRNAs的同源性决定它们是否具有相对保守的生物学功能。研究表明人类和小鼠的 miRNA 均位于保守的共线性区域，已知人类的 miRNA 在小鼠中存在众多同源体[21-23]。另外，研究者在大鼠 miRNAs 中也鉴定出人类 miRNA 的同源体，在一定程度上表明 miRNA 在人类和实验动物间存在一定的同源性[21-23]。迄今为止，已有多项研究证实在 AIS的疾病进展过程中，miRNAs 也很可能扮演着调节者的重要生物学作用。Li 等[24]在 11 例 AIS 患者和 10 例对照者中研究了小关节软骨的形态变化、组蛋白甲基化改变和细胞生长相关的信号通路，结果显示随着年龄的增长，软骨细胞数量增加，而小关节软骨中 BCL2 和 COL2A1 的上调明显减弱。此外，在 AIS 组中，miR-15a 编码基因的启动子区域中组蛋白 3 赖氨酸 9 ( H3K9me3：抑制染色质标记 ) 的三甲基化降低，而 miR-15a 的表达亦降低，与对照组相比，AIS 患者的小关节软骨细胞增殖增加，可能是由调节 miR-15a / Bcl2 途径的 H3K9me3 和 SUV39H1水平升高所致，软骨细胞增殖的这种失调可能导致脊柱脊髓生长异常，并可能参与疾病的发生和发展[12]。Ogura 等[25]对 2142 例 AIS 患者进行了全基因组关联研究( GWAS )，其中 1105 例表现出临床进展，其余 832 例归为非进展组，研究者使用独立队列的 AIS 患者 ( 323 例进展和 283 例非进展患者 ) 进行基因检测，发现含有单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphism，SNP ) rs1828853 的11q14.1 染色体与 AIS 疾病进展密切相关，表明 rs1828853可能会通过改变 miR-4300 的表达来调控 AIS 的进展风险。

二、miRNA 在 AIS 发生、发展中的意义

近年来，非编码 RNA 在 AIS 脊柱畸形的发生中所起的重要作用逐渐被揭示并证实[1-3]。Zhang 等[26]使用miRNA 芯片分析了来自 AIS 患者和对照组的骨组织切片以及来自这些样本的原始成骨细胞中的 miRNA，微阵列分析发现 miR-145-5p ( miR-145 ) 是一个潜在的上游调节因子，miR-145 和 β-catenin mRNA ( CTNNB1 ) 在 AIS 骨组织和原代成骨细胞中均呈高表达，在 AIS 中表达呈现正相关，敲除 miR-145 基因可通过下调活性 β-catenin 的表达及其转录活性来恢复受损的骨细胞活性。AIS 患者循环血 miR-145与血清硬化素、骨桥蛋白和骨保护素呈显著负相关，并首次证实异常 miRNA 表达及其对 AIS 骨细胞功能的影响可能是导致低骨量的致病原因。间充质干细胞的异常成骨分化与 AIS 的发病有关，Zhuang 等[27]对从 12 例 AIS 患者和 5 例对照者中分离出的骨髓间充质干细胞 ( bone marrowmesenchymal stem cell，BM-MSC ) 进行了微阵列分析，发现了 1483 种异常表达的长链 ncRNA，其中 718 种表达下调，765 种表达上调。在正常骨髓间充质干细胞中，lncAIS 与 NF90 相互作用可增加 HOXD8 mRNA 的稳定性，从而增强 BM-MSCs 中 RUNX2 的转录，导致正常骨髓间充质干细胞的成骨分化，相反，lncAIS 在 AIS-BM-MSCs 中的下调不能与 NF90 协同作用，进而破坏 HOXD8 mRNA的稳定性，并阻碍 RUNX2 在成骨分化中的转录[27]。Hui等[28]应用基因芯片技术分析 AIS 患者 BM-MSC 与健康人BM-MSC 的差异表达 miRNAs 情况，利用生物信息学分析验证。该研究从 AIS 患者 BM-MSC 中鉴定出 54 个以前未被发现的 miRNAs ( 12 种上调，42 种下调 )，这些 miRNA参与包括 GTPase 介导的信号转导、DNA 依赖性转录、细胞分裂、细胞黏附、跨膜转运、缺氧反应等途径在内的多种生物学过程，miR-17-5p、miR-106a-5p、miR-106b-5p、miR-16-5p、miR-93-5p、miR-15a-5p 和 miR-181b-5p 可能在 AIS 的发病机制中起重要作用[28]。

AIS 的病因与许多因素有关，如不对称性生长、神经肌肉状况、骨强度、脊柱生物力学特性和遗传因素等。近年来，表观遗传因子被认为是 AIS 发病过程中的重要因子，但有关其分子机制和致病途径的研究仍然缺乏[29-30]。miRNAs 是通过调节重要的细胞途径参与基因表达调控的分子，García-Giménez 等[31]通过 RNA 测序对 17 例 AIS 患者和 10 名健康对照者中的循环血 miRNA 进行了分析，然后在 30 例 AIS 患者和 13 名健康对照中通过 qRT-PCR技术进行了进一步验证。研究发现 AIS 患者循环血中miR-122-5p，miR-27a-5p 和 miR-223-5p 表达水平更高，上述三种 miRNAs 与 miR-1306-3p ( 作为组合的 miRNA 标记 )一起可以将 AIS 患者与对照组有效鉴别 (AUC= 0.95 )，研究表明循环血中的 miRNAs 有望用作 AIS 的潜在诊断生物标志物[31]。张珂等[32]在研究中发现 miR-516、miR-517、miR-495 在 AIS 患者脊柱侧凸的凹侧与凸侧椎旁肌组织中的表达存在明显差异，并且提出 miR-516、miR-517 两种 miRNAs 的表达水平与 AIS 患者的发病年龄和畸形严重程度密切相关。与上述结论不完全一致，杨世伟等[33]研究发现 ENST00000602322.1、HIT000067310、ENST00000440778.K、ENST00000414894.K 等多种 ncRNA在 AIS 患者椎旁肌中的表达水平较对照组显著降低，但在AIS 患者脊柱侧凸凹侧与凸侧之间上述 ncRNA 的表达水平差异无统计学意义。

Jiang 等[34]对 5 例 AIS 患者的椎旁肌组织进行了 RNA测序，发现在凹侧和凸侧椎旁肌肉之间存在过氧化物酶体增殖物激活受体 ( PPAR ) 信号通路和不饱和脂肪酸的生物合成中共 40 种差异表达的基因。在 PPAR 相关基因中，ADIPOQ，FABP4 和 MSTN 在凹侧肌肉组织中呈显著上调，而 H19 作为一种对骨骼肌分化和再生重要的 lncRNA其水平则显著下调，因此研究者提出 ADIPOQ 和 H19 的差异表达 AIS 疾病进程相关[34]。Liu 等[35]进行了人类 Agilent mRNA 和 lncRNA V3.0 芯片检测，以鉴定健康儿童和 AIS患者外周血中 mRNA 和 lncRNA 的表达模式，研究表明 AIS组和健康对照组中的 546 种 mRNAs 和 139 种 lncRNAs 之间存在差异性表达，其中 NR024075 和 ENST00000440778.1分别是上调和下调程度最显著的 lncRNA，在 546 个差异表达的 mRNAs 中，AIS 组中有 34 种 mRNA 下调，而 512种 mRNA 则呈过表达。此外，研究者还探讨了 lncRNA 表达水平与脊柱侧凸临床特征之间的相关性。研究人员发现 TCONS00028768 和 ENST00000440778.1 的表达水平与脊柱侧凸患者的身高密切相关，ENST00000602322.1 表达水平较高患者的发病年龄也较小，在 Cobb’s 角 > 40° 的脊柱侧凸患者中，ENST00000414894.1 的表达较低，而ENST00000440778.1 的较高表达与较高的 Risser 评分相关，研究结果有助于进一步了解 miRNAs 在 AIS 发生、发展、诊断及预后中的意义[35]。

三、前景及展望

脊柱侧凸的遗传和分子生物学发病机制是极为复杂的，其发生、发展过程取决于生物力学、神经肌肉发育和代谢功能异常等多种因素[36-40]。目前，关于 AIS 病因及发病机制的研究逐步开展，从最初的动物实验到人体组织学研究，从检测激素水平、骨量测定到近年来开展的基因连锁分析和关联分析，已经取得了一定的研究基础和成果，但截至目前仍难以完全合理地纵向解释 AIS 的病因及发病机制。目前，该领域面临的重要问题包括：( 1 ) 如何从多维度深入理解 AIS 的发生、发展过程；( 2 ) 如何有效地将既往的基础研究成果向临床应用转化；( 3 ) 如何将 AIS 的基础研究、动物模型研究和人体样本研究结果有机地结合起来。

此外，在 AIS 的不同亚型中，miRNA 的表达情况也有待于进一步论证。从基因组学、代谢组学、蛋白质组学有机结合的整体视角探索并发掘 AIS 的发病机制，明确基因、环境因素与临床表型的相互作用关系及途径，进而为AIS 早期诊断、病情监测及合理治疗提供有力的依据，对进一步的病因干预、防止疾病进展具有重要的价值。发现并论证其在 AIS 发生、发展中的关键作用是该领域未来基础研究的重要方向之一。