非洲猪瘟病毒特征及致病机理研究

何顺宇

(湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128)

0 引言

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种烈性的、具有高度接触传染性、死亡率高且传染速度极快的动物传染疾病[1-2]。其病情传播不受时间、地点的限制，能够感染各种类及各生长阶段的猪群，致死率可达到100%。AFS是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的传染病。该病在临床上主要表示为最急性型、急性型、亚急性型和慢性型4种类型。一般特征为高热和全身性皮下出血，死亡率高；有时会出现神经症状、呼吸困难以共济失调[3]。一旦暴发非洲猪瘟，会对养猪业造成巨大危害[4]。1921年首次在肯尼亚发现非洲猪瘟。1957年在葡萄牙发现非洲猪瘟，蔓延趋势不断扩大至欧洲其他国家[5]。1971年传入南美。2017年传入俄罗斯并扩散。2018年非洲猪瘟秘密传入中国[6]。被世界动物卫生组织(OIE)列为A类疫病，目前无有效疫苗预防[7]。

ASFV是二十一面体双链DNA病毒，其具有双层囊膜结构，基因组大小为170～190 kb[8]，并具有反转重复区和末端交联[9]。ASFV能够编码68种结构蛋白和100多种非结构蛋白，其中50多种为病毒结构蛋白[10-11]。整个基因组有151～167个开放阅读框(ORF)，可以编码150～200个蛋白质，而一半以上的功能未知[12]。ASFV编码的蛋白质与病毒的结构、复制以及调节细胞凋亡和先天免疫等细胞有关[13]。本文主要从病毒编码结构蛋白及致病机理的最新研究进行综述。

1 非洲猪瘟病毒结构蛋白

1.1 核壳蛋白

在非洲猪瘟病毒结构体系中，ASFV的核衣壳部分，位于病毒的内膜下方，具有保护支持的功能，将病毒DNA和核蛋白包裹浓缩形成类核结构。在已知的110个ASFV高度保守的ORFs中，ORF CP2475L编码多聚蛋白前体pp220[11]。核壳蛋白可以被蛋白酶水解成成熟的病毒蛋白，具有一定的生理生化功能，最后组装到含DNA的拟核区域的核芯壳中。pp220位于病毒结构外层核壳区域，进行相应的功能表达及基因编辑。核壳蛋白在ASFV病毒组成体系中，起着至关重要的作用。

多聚结构蛋白pp220是一个N-豆蔻酰化的前提多肽，共肉豆冠酰基部分具有膜锚定信号，能接收信号并将其表达。它可以将发育中的核芯壳，通过其介质联合到病毒粒子的内部囊膜区域；是连接内部核质体和核外层之间的蛋白质支架，起支持作用，能够诱导分配空核体。因此，pp220是核芯组装过程的必需成分[15]。pp220容易被蛋白酶水解，经过SUMO1样蛋白酶水解加工后，水解产生了p150、p37、p34、p14和p5等主要结构蛋白[10]。多聚蛋白的加工过程与病毒组装同时发生，pp220依赖于主要衣壳蛋白p72的表达。先进行pp220前体的诱导表达，才能再进行pp62的加工处理，研究表明这2种多聚蛋白前体彼此之间相互作用，能够促进核壳样病毒结构域的形成[16]。

1.2 囊膜蛋白

ASFV主要由内囊膜层、衣壳层、外囊膜层以及被核壳蛋白包围的病毒DNA基因组构成。其中囊膜蛋白位于成熟病毒粒子的内外囊膜结构区域，是ASFV所编码的主要结构蛋白。在病毒感染宿主细胞的过程中，由于其具有良好的抗原性，与病毒的致病性及细胞的免疫功能密切相关。p54等囊膜蛋白的功能及其结构已知。

ASFV侵染宿主细胞后，早起表达的膜蛋白主要包括p54，由ORF E183L 基因编码。研究表明，p54囊膜蛋白存在于内质网衍生的内膜前体处，对于病毒侵入宿主细胞及吸附细胞表面具有极其重要的作用[18-19]。p54过度表达能促讲细胞凋亡。由于p54能与胞质动力蛋白轻链LC8发生特异性相互作用，使病毒在细胞内进行位置转移并复制生长。两者发生作用的区域中有一段含有13个氨基酸残基的序列片段，该序列片段能够消除Bcl-2对细胞凋亡的抑制作用，从而促进细胞凋亡程序的运行[20]。在ASFV编码的结构蛋白中，p54是一种被证实能促进细胞凋亡的囊膜蛋白，具有重大突破。由于p54具有良好的抗原性，被应用于ASFV血清检测研究，且检测具有极高的特异性，准确性高，应用前景广[21]。

1.3 衣壳蛋白

病毒衣壳具有保护病毒核酸的功能，避免其受到环境中存在的核酸酶或其他理化因素影响而被破坏，且衣壳层部位在病毒感染宿主细胞过程中具有显著功能。由于病毒在感染宿主时需要破坏宿主细胞内的免疫机制，而衣壳部分具有相应的免疫原性，可以对宿主体内的免疫系统进行诱导，影响其免疫过程，不仅使宿主细胞体内免疫系统产生防御物质，还产生对应的免疫损伤，进而使得病毒能在细胞内快速复制表达。研究显示，ASFV编码的衣壳蛋白有p72等。

在ASFV感染宿主晚期，有一类由ORF E102R基因编码的衣壳蛋白p72，其蛋白组成来自于病毒工厂。研究表明，在病毒二十一面体结构中，衣壳蛋白p72是病毒的主要组成部分，能够促进病毒衣壳层的形成及作用表达。在病毒各部分的组装过程中，宿主细胞核内组装的中间体被运输至细胞质内进一步包装，此时p72衣壳蛋白被运输至内质网内膜上，进行衣壳层的组装。其作用机理主要是在感染细胞细胞质的原生内环境中，p72与相对应的病毒分子CAP80相互影响并发生作用[22]。病毒在细胞质内进一步发育至成熟阶段，p72的抗氧化功能也进一步增强，为成熟病毒粒子的扩散埋下基础。在血清检测试验中，p72衣壳蛋白的基因序列高度保守，且在细胞内表现出较好的抗原性[23]，因而可以被用来血清病毒检测，作为开发非洲猪瘟抗体检测试剂盒的抗原。

1.4 DNA结合蛋白

在ASFV编码的结构蛋白中，DNA结合蛋白部分包被非洲猪瘟病毒的基因组，从而组成ASFV的类核区域。其DNA结合蛋白包括p10和pA104R，都位于成熟病毒粒子的类核外层，能够促进病毒类核的组装以及加快病毒粒子成熟的进度，对病毒粒子结构具有显著影响。研究表明，结合蛋白还参与病毒DNA复制和转录翻译等过程，在ASFV作用机制里具有不可替换的作用。当前蛋白质组学研究已经证实ASFV蛋白质组具有复杂性和灵活性[24]。

ASFV编码一种类组织蛋白pA104R和参与基因组复制及包装的细菌蛋白具有高度序列同源性。位于pA104R DNA结合区域69位的精氨酸被发现与高效的DNA结合位点活性相关。siRNA敲除实验表明，pA104R在病毒DNA复制和基因表达时发挥着关键作用，转染细胞显示更低的病毒子代(最多-82.0%)、更低的病毒基因组拷贝数(-78.3%)和更低的晚期病毒基因转录(-47.6%)[22]。

pA104R与细菌HU/IHF家族成员在序列和功能上具有相似性，是病毒复制所必需的。Apo-pA104R形成同源二聚体，并折叠成保存在细菌热不稳定核蛋白/整合宿主因子(HUS/IHFs)中的结构。而pA104R-DNA复合体结构揭示了pA104R具有与其细菌同源物不同的DNA结合模式[25]。

pA104R与参与基因组复制和包装的细菌蛋白具有广泛的序列同源性。通过定点诱变，发现位于pA104R DNA结合区域69位的精氨酸与高效的DNA结合活性相关。研究表明，pA104R参与了病毒DNA拓扑的调控，可能参与了病毒DNA的复制、转录和包装。pA104R在感染后期表达，并在病毒DNA复制位点积累。这些结果表明pA104R参与了病毒DNA拓扑结构和基因组包装的调控，提示A104R缺失突变体可能是一种很好的AFS疫苗开发对象[22]。

2 致病机理

2.1 ASFV与宿主细胞

ASFV侵入宿主体内后，其复制主要在家猪和野猪的巨噬细胞内完成。前期阶段，ASFV首先跟体内红细胞粘合，再经过血液运输至巨噬细胞，由细胞骨架微管转移至巨噬细胞核壳处，再侵入细胞核内核酸处，开始进行复制表达，从而制造大量的ASFV并运输至身体各部分的组织中。这个过程首先进行mRNA的转录与翻译，提供合成DNA病毒所需的原材料，随后在细胞核内开始复制，产生中间体后转移至核外继续包装；后期阶段，病毒DNA、膜组分、结构蛋白、某些宿主蛋白被波形蛋白和线粒体包裹，与此同时病毒RNA也转移到细胞核的周围，进行大量高效的病毒复制，最终包装完整的病毒粒子沿微管被运送至细胞膜并释放到细胞外[26]。当前蛋白质组学研究已经证实，ASFV蛋白质组具有复杂性和灵活性，具有病毒复制、吸附、侵入宿主细胞、复制与装配、逃避免疫防御系统等功能。ASFV的复制表达与基因的转录调控有关联，感染细胞质内的DNA复制开始后，病毒转录发生转变，使得ASFV 的复制具有相对自主性，其基因表达可以精确调控。

单核-巨噬细胞是最先被感染的地方，其次是树突细胞、内皮细胞、巨核细胞、血小板、中性粒细胞和肝细胞[27，28]。ASFV结构最外层的核壳部分，上面存在与目的细胞表层结合位点相识别的信息物质，细胞表层物质有利于病毒的侵染及加快病毒在细胞内的扩散，在病毒防治上具有研究意义[29]。

2.2 ASFV与宿主动物

非洲猪瘟主要在家猪和野猪中传染，因而是ASFV入侵的主要宿主生物。ASFV侵入宿主细胞后进行复制表达，在胞内快速繁殖，入侵宿主体内的各系统。研究表明，病毒主要入侵宿主的呼吸系统和消化系统，病毒首先在扁桃体内增殖，然后进入循环系统，引起呼吸及免疫系统损伤等表现[30]。随后病毒在骨髓、肺脏及肝脏处进行复制表达。

ASFV在不同宿主间作用跟病毒的致病性密切相关。对于家猪而言，不同毒株对家猪的致病力表现不同，机体感染病毒后出现亚临床感染到急性死亡等不同的症状；对于野猪而言，其与家猪表现出不同的特征，野猪感染ASFV后常表现为无明显症状且仅伴有低病毒血症，

3 展望

非洲猪瘟在我国的流行，对我国养猪业造成了严重经济损失。面对严峻形势，除了加强生物安全宣传外，加快疫苗研制是目前最佳的防控手段。哈尔滨兽医研究所研制了某株 ASFV复制基因片段缺失的弱毒性病毒，该疫苗病毒敲除了控制ASFV复制表达的基因片段，保留其病毒蛋白的良好抗原性。临床试验表明，接种该疫苗的猪群生长状况良好，无明显感染非洲猪瘟症状。其作用机理是影响病毒在宿主细胞体内的复制扩散，可以有效抵抗同源病毒株系的侵染，以及保护非同源株系病毒的感染。但弱毒性病毒在猪体内是否会发生病毒基因重组以及出现毒力返强现象，敲除控制复制的基因片段是否会导致原保护作用的丢失，以及疫苗病毒的生物安全性等都需要更进一步的研究；亚单位疫苗的制备主要是利用ASFV编码某些蛋白具有诱导保护性免疫的机理，其疫苗本身不含核酸，但能诱导受体产生相对应株系的抗体。相较于弱毒性疫苗，不会出现基因重组诱导毒力返强现象，但未证实某种编码蛋白只提供免疫保护。此外，研究表明缺乏pA104R基因的ASFV可以作为开发ASF疫苗的一种策略。

AsfvAP采用了一种不同于其他APs的新型DNA结合模式。AsfvAP拥有许多独特的结构特点，包括一个窄nucleotide-binding口袋活性部位，C16～C20的二硫键包含区域等。根据实验可知，这些特性对AsfvAP适应酸性和氧化环境很重要，可以作为设计小分子抑制剂的靶标，从而破坏修复ASFV基因组的过程以对抗该病毒[31]。

目前在弱毒性疫苗研制上取得了重大突破，且技术相对成熟。出于对弱毒性疫苗生物安全性的考虑，需要优化敲除控制ASFV复制的基因片段组合。一方面需要确保弱毒性疫苗的免疫原性在宿主体内正常表达；另一方面要确保其在宿主内不发生基因重组，使毒性返强。因而，生物安全性是制约弱毒性疫苗大规模生产的重要因素。