茶树原生质体制备体系的研究进展

叶晶晶 赵 东 梁月荣 陆建良 郑新强

(浙江大学茶学系，杭州 310058)

茶树(Camelliasinensis(L.) O. Kuntze)特征性次生代谢产物丰富，属于重要的经济作物[1]，目前新品种的培育仍以传统的育种方式为主，育种效率低，定向育种技术薄弱。通过基因功能鉴定和克隆技术，与次生代谢产物相关的遗传编码陆续被成功破译，但茶树的遗传背景相对复杂，基因功能的研究明显滞后。与传统的遗传转化系统相比，瞬时过表达/抑制为体内基因功能分析提供了一种方便的替代方法。原生质体可广泛应用于植物瞬时表达分析。基于原生质体的表达系统不仅可用于酶活性测定，也可用于亚细胞定位分析，还可以用来研究蛋白质-蛋白质相互作用和转录激活，而且原生质体是克服远缘杂交障碍、创新品种的重要载体[2]。

原生质体早在1892年就由Klercker[3]通过机械法从水剑叶叶片中获得，但一直到1960年，Cocking[4]利用酶解法从番茄根尖获得产量大活力高的原生质体，原生质体制备研究才真正开始。目前，许多模式植物和粮食作物例如烟草[5]、拟南芥[6]、玉米、小麦、水稻[7]等的原生质体分离技术已经非常完善，应用领域在不断拓宽。

Rona[8]于1972年利用酶解法建立了欧亚槭的原生质体再生体系，开创了木本植物的原生质体培养先河。目前，桑树[9]、柑橘[10]、苹果[11]、枇杷[12]、橙[13]、中国李[14]、狗头枣[15]、柿[16]、山杏[17]、荔枝[18]、菠萝[19]、草莓[20]等多种园艺植物的原生质分离、培养及融合等研究工作已取得重要的进展。此外，一些具有经济价值的木材和能源树种，例如银杏[21]、橡胶树[22]、油桐[23]、日本榧[24]、国槐[25]、油棕[26]等以叶片为材料在原生质体制备方面也有了很大的进步。

茶树原生质体研究起步迟而且少。中村顺行[27]以茶树新梢嫩叶和花瓣为材料分离得到原生质体，但并未说明其细胞活性。之后的30余年间仅有一篇茶树花粉管亚原生质体分离的报道[28]。直到2016年杨子银等[29]、王璐等[30]申请专利，以茶树花瓣为材料制备得到原生质体，并证明其具有良好的外源基因表达活性。随后刘艳丽等[31]以茶树品种‘鄂茶1号’的幼苗叶片为材料制备原生质体，彭章等[32]以暗培养的茶树幼嫩叶片和胚根原生质体为材料建立了原生质体分离体系，为茶树体细胞杂交等细胞水平的研究提供了获取原生质体的方法。

但是，对茶树原生质体的大规模分离还不成功，以往的研究试图从茶叶、花和胚根中分离原生质体，但是所用材料的条件严重限制了茶叶原生质体分离的可行性。了解原生质体的制备分离鉴定体系，有助于建立茶树的原生质体培养及瞬时表达系统。本文依原生质体的制备体系流程的各个环节介绍了原生质体获取的影响因素及研究进展，为完善茶树原生质体制备体系提供理论依据。

1 原生质体制备体系

植物的原生质体制备体系包含制备材料的选择、原生质体分离和原生质体纯化。

1.1 制备材料的选择

制备材料的基因型、材料的组织类型和生理状态是材料选择时需要考虑的因素。现有植物原生质体培养的主要起始材料有幼胚[14]、幼叶[15,19]、幼根[32]、愈伤组织[10,13,16]、胚性细胞悬浮物[17-18,20,33]、雌雄配子体[34]等, 使用最多的是叶片、愈伤组织和悬浮培养物[35]。在茶树原生质体制备的已有报道中，主要以叶片、花瓣为材料，且通常选择幼嫩叶片或数周龄实生苗的叶片。

对制备起始材料进行黑暗等预处理，可能有利于酶解效率。王璐等[30]为提高酶解效果，使得酶液能充分深入植物组织中，将盛有酶解液和茶树花瓣的培养皿先置于真空泵中于黑暗条件下抽真空40min～1h再进行酶解；刘艳丽等[31]在酶解前将叶片于含0.5～0.6 mol/L甘露醇的原生质体漂洗液中静置30 min，促使质壁分离。此外，为了扩大材料与酶解液的接触面积，提高酶解效率，通常会将叶片或花瓣切成宽0.5～3 mm的细条或5 mm2的小块[27-32]。

1.2 原生质体分离

分离原生质体的方法主要有机械法和酶解法，现在最常用的是酶解法[36]。应用最广泛的酶有纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、崩溃酶和离析酶等。彭章等[32]研究发现‘福鼎大白茶’分离原生质体的最佳酶为纤维素酶、离析酶和果胶酶，其中幼嫩叶片和胚根的三种酶组合分别是1.5%、0.1%、0.5%和1.5%、0.3%、0.5%；而‘鄂茶1号’品种的实生苗叶片分离的最适酶组合用量为1.5%纤维素酶和2.5%离析酶[31]。但不同研究中所使用的酶的种类和浓度都不同，且多为单一因素的研究，所得结果的适用性不高。

原生质体的分离效率还与酶解温度和时间、酶解液的pH值和转速有关。通常木本植物的酶解温度在室温25 ℃左右，酶解液pH在5.6～5.8之间，茶树原生质体分离实验中pH值多为5.7或5.8；为防止原生质体机械损伤，转速通常控制在50～100 rad/min，在茶树已有报道中摇床转速多为50～55 rad/min。由于分离材料的差异性，不同品种及不同类型材料的酶解时间差距较大，一般在4～18 h之间，茶树花瓣和胚根的最佳酶解时间比较相近，为6～8 h，而叶片的酶解时间一般长于10h，有研究认为16～18 h最佳[27-32]。已有研究的酶解时间均比较长，不利于操作。理论上酶解转速越高，酶解速度越快，酶解时间越短，但茶树原生质体方面的研究少，多少转速更加适合茶树材料的酶解尚缺乏依据。

为了防止游离出来的原生质体破裂，酶解液中需添加稳压剂以维持合适的渗透压，不同植物所需要的渗透压有所差异，甘露醇[18]、山梨醇[16]、蔗糖[37]等均有调节渗透压的作用，其中甘露醇最为常用，浓度在0.4～0.6M之间，最佳浓度视品种和材料类型而变化。同时，为了防止质膜损伤，酶解一般放置在黑暗或弱光环境下进行。

此外，实验证明在混合酶液中加入一定量的MES能稳定酶解液pH值，而PVPP、抗坏血酸[38-39]、柠檬酸、氯化钠[39]等可以有效减轻酶解过程中原生质体的褐化程度。酶解液中加入1% PVPP和2mmol/L抗坏血酸后从茶树叶片游离出来的原生质体的褐化程度降低，呈轻微褐绿色，说明二者可以降低多酚氧化，提高原生质体的质量[31]。

1.3 原生质体纯化与活力检测

经过酶解处理后，得到的混合液中成分复杂，除了原生质体外，还有未解离细胞、细胞或原生质体碎片等。这些混杂物会对原生质体造成伤害，因此需要去除杂质，以获得高活力的高纯度原生质体。

原生质体纯化的方法主要有沉降法、漂浮法和界面法[36]。沉降法应用最广泛，操作方便损失少，但是纯度不高[40]；漂浮法得到的原生质体纯度高，但是收率比较低[41]；界面法得到的原生质体大小均匀一致，但是收率也比较低。已有研究中报道过应用沉降法和界面法进行纯化[29-31]。而FDA法(荧光素二乙酸)和台盼蓝染色法是最常用的检测原生质体活力的方法[42]。彭章等[32]采用沉降法和台盼蓝染色法分别测定产量和活力，明确在最适处理条件下‘福鼎大白茶’的幼嫩胚根分离产量可达3.2×106个·g-1，活力89%，幼嫩叶片分离产量为8.8×106个·g-1，活力88%。

2 当前存在的问题

目前已有不少木本植物建立了比较完善的原生质体制备体系，而茶树原生质体分离的报道较少，仍处在不断探索的阶段。

从分离材料来看，在现有研究中，分离材料相对单一，而且每项研究中往往只选择一个品种进行原生质体分离条件的探究，具有一定的局限性。在两份专利申请中，选定茶树花瓣为分离材料[29-30]，但一方面花瓣获得具有季节性，另一方面在生产茶园中茶树花量较少，材料来源受限。其他报道选择的分离材料以实生苗叶片为主，在室内培养，嫩度较高，原生质体分离难度相对小，但是获取材料要求的时间长，首先需要获得健康有活力的茶树种子，经过栽培，茶籽萌发，长出4、5片真叶才能取材实验，而茶树种子一年中只有10～11月份才有收获[43]，所以取材仍然存在限制。而栽培型茶树的叶片在结构上更为复杂，角质层和蜡质层相对较厚，而且栅栏组织层次多[44]，使得酶解液不容易深入叶片的叶肉细胞内部，增大了原生质体分离的难度；由于茶树为多年生植物，叶片成熟度较高，彭章等[32]在研究中曾以茶园生长的茶树的一芽三叶为材料进行原生质体分离，但是在其处理条件下并未获得完整的原生质体，而且产生了大量的碎片，说明叶片成熟度对分离效率存在一定影响；此外，茶叶中的多酚类物质在细胞被酶解时易被氧化而使所得的原生质体活力下降[31-32]。胚性悬浮细胞或愈伤组织等更能忍受酶对细胞膜的伤害，且易培养、易分化等，是其它木本植物获得原生质体的常用制备材料[45]，但建立稳定可靠的悬浮培养体系需要多次继代，而且由胚性愈伤到胚性悬浮细胞需要3个月[46]，周期较长。中村顺行[27]曾以愈伤组织为材料进行原生质体分离，但效果不佳，仅分离出少量细胞。

从酶解条件来看，不同文献中酶解液的组分及比例有一定的差异，无法直接比较分离效果，已有的文献中主要使用纤维素酶、果胶酶和离析酶对原生质体进行分离，由于材料的差异性，存在多种不同的最适组合，需要综合考虑酶解时间、产量和活力等多个因素，因此尚未有可参考的标准。在渗透压的选择上，刘艳丽等[31]认为0.5M甘露醇浓度较适宜，而彭章等[32]则发现在0.4M甘露醇浓度的环境下原生质体的状态最好，说明在不同的实验条件下，处理条件的优化具有一定的针对性。在酶解效果的鉴定上，中村顺行[27]和刘艳丽等[31]在研究中重点关注原生质体的形态完整性，只是定性描述了外形和数量差异，缺乏活力鉴定。可见在原生质体制备过程中，由于变量过多，实验的重复性较差，因此在研究过程中需要建立新的研究体系，以期最大限度扩大制备材料获取来源和提高原生质体产量和活力。

从原生质体应用来看，虽然目前已经有报道证明了茶树原生质体分离的可行性，但目前的实验基本上大都处在原生质体制备阶段，杨子银等[29]在2016年申请的专利中将外源基因转化入茶树花原生质体，表达率可达30%以上，证明原生质体可用于基因功能验证和亚细胞定位等方面；彭章等[32]进行了原生质体应用的初步探索，利用PEG法尝试把分离到的原生质体融合，获得10%的融合率，但后续并未有详见报道。在现有的茶树原生质体制备体系中，分离材料需要经过一系列繁琐的步骤才能最终得到原生质体，在此过程中容易受到机械损伤和化学损伤，原生质体的活力大大降低，原生质体培养的难度加大，而且成活率不高，进一步阻碍了原生质体的应用。因此，建立一种简便高效且获取原料易得的茶树原生质体制备体系，对于茶树新品种创制、特异性代谢产物生物合成的瞬时表达、基因功能验证等研究是很有必要的。

3 研究展望

综合考虑实验材料的特性，笔者认为未来以叶片为主要材料进行原生质体制备将有更多的可能性。首先，在一定程度上可以解决一些材料的季节性限制，而且取材更方便、材料更丰富。针对茶树叶片的结构特点，目前已经有直接去除叶片表面蜡质的方法[47]，或可借鉴。虽然茶树叶片中存在大量的多酚类化合物，但抗坏血酸和PVPP已被证明能有效减轻原生质体的褐化，提高活力。组培苗和实生苗的生长不受环境气候影响，可以保证叶片嫩度；而栽培型茶树的嫩叶生长的时间跨度长，生长轮次多，可以较长时间供应材料。由于愈伤组织和胚性悬浮细胞的细胞壁较薄，没有角质和蜡质的阻碍，作为实验材料理论上可以有效降低分离难度。

影响原生质体分离效率的因素较多，而通过正交实验对不同品种不同类型的材料进行处理，可以明确单个因素对于结果的影响水平，从而优化实验参数，确定不同材料原生质体制备所需要的最佳条件范围，构建出适用于大多数茶树品种的原生质体分离体系。谷战英等[23]通过正交试验研究发现在四个因素中(纤维素酶、离析酶、酶解时间及甘露醇浓度)，酶解时间是影响油桐原生质体产量获得和活力大小的最大因素，进而建立了油桐叶肉细胞原生质体分离体系；王欢等[48]以刺槐愈伤组织为材料进行5因素4水平的正交试验，认为酶液质量分数和果胶酶对结果的影响最为显著。此外还可以通过切片观察叶片栅栏组织和海绵组织的厚度以及角质层、蜡质层的分布，可以探究叶片嫩度与最适处理条件之间的关系[49-50]，发现叶片结构与最适酶浓度之间的潜在规律。