颅缝早闭的分子机制及硬脑膜作用的研究进展*

张司玺，曹志威，申 杰，张春阳

[1.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014010；2.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院神经外科；3.包头医学院神经外科疾病研究所(转化医学)；4.内蒙古自治区骨组织再生与损伤修复工程技术中心]

婴幼儿时期，颅骨成扩张性生长的状态以容纳成长中的脑，这种生长主要发生在来源于未分化的间充质细胞形成颅骨之间的窄缝，称为颅缝[2]。在新生儿中，颅缝的存在使婴儿的头骨更容易通过产道，并在出生后允许颅骨在大脑发育过程中进行代偿性生长。当一个或多个颅缝过早闭合时，颅骨形状的继发性变形是由于缺乏垂直于闭合颅缝的生长，以及未闭合颅缝的补偿性过度生长所致[3]。研究表明[4]，颅缝早闭的患病率逐年上升，但无明显原因。环境因素(如宫内胎头受限、胎位异常、羊水过少、产前暴露于致畸物质、母亲吸烟、丙戊酸和苯妥英等抗癫痫药物)和基因(单基因突变、染色体异常和多基因突变)都可能是该病的易感因素。遗传因素约占所有颅缝早闭的20 %，大多数与颅缝早闭相关的基因以常染色体显性方式存在。

根据闭合颅缝的不同将颅缝早闭分为矢状缝早闭(60 %)、冠状缝早闭(23 %)、额缝早闭(15 %)、人字缝早闭(2 %)以及多条颅缝闭合的复杂性颅缝早闭[5]。此外，根据临床表现颅缝早闭可以分为综合征性的，例如Apert、Crouzon或Saethre-Chotzen综合征，以及更常见的非综合征性的颅缝早闭，例如舟状头畸形(矢状缝早闭)、前部斜头畸形(冠状缝早闭)、后部斜头畸形(单侧人字缝早闭)、三角头畸形(额缝早闭)、短头畸形(双侧冠状缝早闭)。而综合征性颅缝早闭除颅骨畸形以外，还有躯体其它部位的畸形如Apert综合征的并指畸形，Crouzon和Saethre-Chotzen综合征的特殊面部畸形，甚至还会引起患儿的认知功能发育障碍[2-3]。这些症状不仅威胁到患儿脑的正常发育，还对其身心健康发展造成长远影响。因此通过研究颅缝早闭分子机制为临床治疗手段提供新的思路，提高治愈率显得尤为重要。

1 分子机制

颅缝早闭已被证明是由多种基因突变引起，包括：MSX2，FGFR1、2、3，TWIST1，TGFBR1、TGFBR2，ERF，纤维蛋白-1(FBN1)，EFNB1，EPHRINA4(EFNA4)，RAB23，Notch配体，JAGGED1，RECQL4，MASP1，SH3PXD2B，FREM1，ALX4，和SKI。其中最常见的突变基因是FGFR2，Twist1和EFNB1[6]。

1.1Twist1基因 Twist1主要表达于胚胎中胚层，在诱导细胞移动和组织塑形中起重要作用。人类Twist1的杂合突变导致综合征型颅缝早闭—Saethre-Chotzen综合征[7]。有研究表明冠状缝位于神经嵴来源的额骨和中胚层来源的顶骨之间，颅缝本身起源于中胚层，而Twist1突变小鼠胚胎颅缝碱性磷酸酶染色显示，额骨和顶骨的成骨细胞与冠状缝的非成骨细胞之间边界的完整性丧失[6]。与此同时，在冠状缝外的一层细胞中，ephrinA2、ephrinA4和EphA4的表达减少。Ephrins是与Eph受体相互作用的膜结合配体，Eph受体是一大类受体酪氨酸激酶。Ephrin-Eph信号调节多种发育过程，包括发育边界的建立。因此在细胞中Twist1的控制下，ePhin信号作用于维持冠状缝处的成骨-非成骨边界，失去这一边界的完整性会导致成骨细胞进入颅缝，导致颅缝具有成骨特性，并最终导致颅缝的骨化。

1.2EFNB1基因 Ephin-B1由EFNB1基因编码，属于Eph受体(受体酪氨酸激酶)配体的B亚类。Eph/ephrin信号对胚胎的发育过程起到重要作用，包括骨骼和面颅的发育。X染色体连锁的EFNB1基因杂合突变会导致一种特定的综合征颅缝早闭-Craniofrontonasal syndrome(CFNS)[8]。有实验通过检测小鼠Efnb1在胚胎期(E)9.5 d和10.5 d(额顶边界建立的时间)的RNA表达，发现最顶端的Efnb1表达区域与神经嵴起源的、未来的额骨区域和潜在的端脑小泡神经上皮相对应，但在形成顶骨的间充质中缺失[9]。小鼠Efnb1在神经嵴表达，但不在头部中胚层表达。因此，在这些组织交界处形成的冠状缝位于Efnb1表达的边界。研究表明Eph受体和ephrins的表达是相互的，通过界面上的排斥性相互作用，组织细胞的定位和/或移动，包括限制迁移神经嵴细胞(NCC)到胚胎的特定区域[10]。而通过对基因敲除(KO)Efnb1小鼠的分析发现不表达ePhin-B1的细胞出现同型细胞分类，形成异位组织边界。综上所述，EFNB1通过对特定细胞的分选对建立和维持颅缝边界发挥作用，若该基因缺失会出现组织细胞混乱从而形成异常边界导致颅缝早闭。

2 硬脑膜与颅缝早闭

大量实验研究和临床证据表明，硬脑膜影响上覆缝线复合体的生物学功能[11]。在动物模型中观察到硬脑膜的骨诱导特性，其中颅盖骨移植物的矿化和额后缝闭合取决于与完整硬脑膜的接触。在临床领域，颅缝早闭的患者仅拆除缝线往往会导致缝线的再骨化。目前，手术包括切除受影响的缝线和复杂的颅骨重塑过程，仍然是标准的治疗方法[12]。然而，这些手术对婴儿患者来说是生理上的严峻挑战，而且切除的缝线极易复发。未来颅缝早闭微创疗法的发展有赖于对颅缝生物学调控机制的透彻理解。因此了解硬脑膜对颅缝发育的影响机制对解决颅缝早闭这一难题尤为重要。

硬脑膜是硬脑膜成纤维细胞产生的富含胶原骨架的纤维组织。胎儿和新生动物的未成熟硬脑膜似乎也含有成骨细胞亚群，这些细胞亚群可以分化为成骨细胞，也可以通过旁分泌信号促进颅骨成骨细胞分化。许多研究表明硬脑膜通过转录因子、激素和生长因子调节成骨细胞的增殖和分化来引导颅骨和颅缝的发育。其他研究也证明未成熟的硬脑膜细胞具有分化为成骨细胞的能力，从而产生骨基质蛋白[13]。

2.1FGFR2基因 成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)是一种表达于缝隙间充质﹑成骨前缘和硬脑膜的跨膜受体，在细胞迁移、血管生成、上皮间充质相互作用以及骨的发育和修复中发挥重要作用，已被证明在体内和体外以旁分泌或自分泌的方式促进成骨细胞的增殖和骨形成。其突变与颅缝早闭的发病机制有关。FGFR2中C278F或P253R突变分别导致Crouzon综合征和Apert综合征[14]。目前有实验通过将突变型FGFR2(C278F和P253R)构建体亚克隆入腺病毒载体中，获得重组腺病毒FGFR2，并将这些腺病毒转染到硬脑膜细胞和成骨细胞中[15]。发现直接转染Crouzon(C278F-FGFR2)突变的成骨细胞显示细胞增殖增加。直接转染Apert(P253R-FGFR2)突变的成骨细胞显示碱性磷酸酶活性增加。在共培养实验中，与Crouzon转染的硬脑膜细胞共培养的成骨细胞表现出明显的细胞增殖，而与Apert转染的硬脑膜细胞共同培养的成骨细胞表现出明显的碱性磷酸酶活性。此外，成骨基因(碱性磷酸酶、骨桥蛋白和Runx2)的表达在成骨细胞与表达Apert的硬膜细胞共培养中上调。Crouzon(C278F-FGFR2)突变可以促进细胞增殖，提示硬脑膜可能通过增加缝隙间充质中的成骨细胞数量来促进Crouzon综合征的缝线融合。而硬脑膜细胞中的Apert(P253R-FGFR2)突变增加了共培养中成骨细胞的成骨分化。综上所述，硬脑膜细胞中的P253R-FGFR2和C278F-FGFR2突变都改变了正常的硬脑膜信号。这提示FGFR2突变可能部分通过结构性突变诱导硬脑膜FGFR信号转导，增强硬脑膜介导的成骨作用，从而诱导颅缝早闭。

2.2不同硬脑膜区域作用的差异性 颅缝包括额缝、矢状缝、冠状缝、人字缝和鳞状缝。出生后额缝首先闭合，其次是人字缝，矢状缝最晚闭合。因此猜测不同硬脑膜区域在促进颅缝发育时具有时间和空间上的差异性。有实验通过在SD大鼠身上进行自体移植手术，将额后缝和冠状缝重新定位在非缝线、额后缝或冠状缝相关的硬脑膜区域上：(1)原位(对照组)，(2)旋转45°，(3)旋转90°。手术在大鼠出生后第8 d，即大鼠额后缝闭合之前进行[11]。术后1个月检查不同的硬脑膜区域对额后缝和冠状缝通畅率、闭合率的影响。结果发现对照组所有标本都显示正常缝线形态，额后缝闭合，冠状缝保持通畅。额后缝的闭合遵循正常顺序，从前到后，从颅内到外颅的方向进行。45°组覆盖在非缝线硬脑膜上的额后缝显示完全融合，但均薄于对照组，且独特的颅骨内脊也明显变钝。旋转的冠状缝仍然开放。90°旋转组覆盖在冠状缝相关硬脑膜上的额后缝均闭合，但其形态明显比对照组薄。旋转的左冠状缝线覆盖在与额后缝相关的硬脑膜上，均被发现是开放的，然而这些冠状缝采用了额后缝的形态。同时有证据证明与移植的成人硬脑膜相比，移植的未成熟硬脑膜可以诱导颅骨缺损的骨再生。缝线下局部硬脑膜的操作被证明可以诱导或阻止颅缝融合[16]。这些研究表明，来自硬脑膜不同区域的细胞行为不同，其中一个区域可能促进成骨和颅缝融合，而另一个区域则维持颅缝通畅。此外，硬脑膜的同一区域可能会随着时间的推移而改变，在发育早期保持缝线通畅，并在面颅骨成熟时允许缝线闭合。因此，硬脑膜细胞可能包含具有促成骨能力的细胞和被编程为抑制成骨和颅缝闭合的细胞。

3 总结

颅缝早闭，尤其是综合征型，通常与认知发育受损的较高风险有关。这是由于大脑生长受限，以及过度生长的缝线和增加的颅内压导致脑组织继发变形所致。因此了解该疾病的患病机制对提高患儿治愈率及降低致畸致残率具有重要意义。颅缝早闭的致病原因中，基因突变大约占20 %。例如：(1)FGFR2突变增强颅缝间充质细胞的成骨活性，从而使颅缝过早闭合；(2)Twist1和EFNB1突变破坏颅缝与周围组织的成骨-非成骨边界的完整性或形成异常的成骨-非成骨边界，导致成骨细胞进入颅缝内并激活其内间充质细胞的成骨活性，最终导致颅缝骨化。此外硬脑膜通过分泌一些可溶性因子来控制颅缝的生长发育。目前治疗手段多是手术切除早闭的颅缝并人造缝线，但其中一部分患者会复发，给患者和家庭带来严重的痛苦和负担。因此可以考虑在手术中补充一些外源性因子或利用细胞工程，在缝线处调控颅缝的闭合进程，进而防止颅骨畸形的产生。

颅缝早闭综合征的特征相互重叠，即使在同一综合征中也存在表型异质性，尤其是在Muenke综合征的情况下，临床评估不足会导致误诊，而分子检测有助诊断。在有FGFR2、Twist1和EFNB1基因突变的儿童中，67 %的儿童需要重复面颅外科手术，而在染色体异常或没有基因诊断的患者中，只有6.25 %的患者接受或计划再次手术。仅靠临床表现来诊断颅缝早闭往往会出现误诊，例如最初诊断为Pfeiffer综合征的患者，通过基因诊断实为Twist1基因突变导致的Saethre-Chotzen综合征；最初诊断为Apert综合征的患者，通过基因检测后纠正为EFNB1基因突变导致的CFNS综合征[17]。因此通过分子检测建立完善的基因型-表型相关性分析，对不同类型颅缝早闭的鉴别诊断具有重要意义,达到早诊断早治疗的目的。

鉴于颅缝早闭是一种由多因素相互作用导致的复杂性疾病，其诊断﹑评估﹑治疗及康复是一漫长而艰难的过程。因此对颅缝早闭患者的临床评估和描述应由包括分子遗传学家在内的专门医疗团队进行，彻底的临床评估可以指导分子检测，从而全方位的提高患者的生存质量。