嵌合抗原受体T细胞治疗胶质母细胞瘤的研究进展

吴 勇综述 黄书岚审校

作者单位：430060 武汉，武汉大学人民医院神经外科（吴 勇、黄书岚）

胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是成人最常见的颅内原发性恶性肿瘤，中位生存期约15 个月[1]。目前，新诊断的GBM 标准治疗包括最大化安全切除、替莫唑胺化疗联合同步放疗等[2]。即使采用综合治疗，很短时间内仍不可避免地出现复发，预后不良。由于肿瘤的异质性、化疗耐药性、血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）等因素，使得GBM 的传统治疗面临巨大的挑战。近年来，嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T-cells，CAR-T）疗法在治疗GBM 中取得许多进展。本文介绍CAR-T 治疗GBM的最新研究进展以及面临的挑战。

1 CRA-T治疗机制

嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）是特殊的人工蛋白，分为细胞外、跨膜区及细胞内三部分，其中胞外部分具有特异性结构域可以识别肿瘤表面相关抗原，而且不需要依赖主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）的介导，从而避免了肿瘤通过下调MHC 进行免疫逃逸；跨膜结构域将胞外与胞内结合为一体，起到信息传递的作用；而胞内部分包含酪氨酸酶活化序列，可激活T细胞毒性及增殖，发挥靶向性的抗肿瘤效果[3]。

经过更新迭代，CAR 不断完善。第1 代CAR 胞内仅有1个T细胞信号结构，只能简单识别靶细胞及活化T 细胞，因此在体内存活时间短，抗瘤作用甚微。第2 代CAR 在第1 代的基础上增加了1 个共刺激分子信号（如CD27、CD28、OX40、4-1BB等），实现了共刺激分子、胞内信号域的双重活化，使T细胞可以自我增殖，并释放一些增强细胞功能的因子。第3 代CAR 同时拥有2 个共激分子，T 细胞可持续增殖，明显增强了杀伤肿瘤的作用。第4 代CAR 加入了更多的功能元件，包括可控开关、自杀基因、增强T细胞功能的分子等。

2 CAR-T治疗GBM的可行性和优势

美国食品和药物管理局在2017 年批准了两款CAR-T用于血液恶性肿瘤的临床治疗。鉴于CART 在血液系统肿瘤中突出的疗效，越来越多的研究将CAR-T用于实体肿瘤治疗。

颅内淋巴管的发现以及效应T 细胞运输的研究，使得中枢神经作为免疫特区的概念被推翻，使GBM 的免疫治疗有了理论基础[4]。肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）与肿瘤相关抗原的丰度呈正相关。由于胶质瘤的TMB相对较低，新抗原不足以使T细胞识别肿瘤；并且，GBM初级免疫应答的产生受到抗原特异性T细胞受体信号传导和抗原非依赖性共刺激信号传导缺陷的限制。而CAR构建体包含有共激结构域，不需要刺激初级免疫应答。胶质瘤干细胞（glioma stem cells，GSCs）对放、化疗不敏感，是治疗失败的关键原因。CAR-T 疗法对GSCs有效，并有根除这类细胞的希望。

3 CAR-T在GBM中的具体应用

3.1 IL-13Rα2 CAR-T 细胞IL-13Rα2 的表达与胶质瘤的级别呈正相关，超过70%的GBM 呈过表达，正常脑组织几乎不表达。高表达IL-13Rα2，激活Src/PI3K/Akt/mTOR 信号通路，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移[5]。IL-13Rα2是细胞因子IL-13受体中的2 个亚基之一，IL-13 以低亲和力结合IL-13Rα 1，随后IL-13Rα1 与IL-4Rα形成异二聚体，激活STAT6信号通路，诱导细胞凋亡。IL-13Rα2以较高的亲和力结合IL-13，是一种诱饵受体，为肿瘤细胞的凋亡逃逸机制。

2015年，Brown等[6]通过术后瘤腔给予第一代靶向性IL-13Rα2 的CAR-T 治疗复发性GBM 共3 例，最长存活时间约14 个月，其中2 例有客观的影像学表现，出现的头痛和短暂神经功能缺损等不良事件可控制；第一代IL-13Rα2 CAR-T 在体内存活时间约14 d，缺乏持久性。2018 年，Brown 等[7]在前期的基础上进行了优化，开发出第二代IL-13Rα2 靶向CAR-T，称为IL-13BBζT，减少脱靶细胞受体的相互作用，增加了细胞内信号传导结构CD137（4-1BB），同时加入用于细胞追踪和富集的截短信号CD19（CD19t）；小鼠模型实验表明IL-13BBζT 比第一代CAR-T 拥有更高、更持久抗肿瘤效应，并未出现明显的毒性反应，还发现肿瘤局部给药途径似乎更优于静脉内全身给药。有临床试验报道[8]，瘤腔内先后6 次输注第二代IL-13Rα2 CAR-T 治疗1 例复发的多灶GBM，在输入部位未见肿瘤生长，后因颅内其他部位和脊髓新发肿瘤进行10次脑室内给药，第三次脑室给药后观察到所有颅内和脊髓肿瘤均明显缩小。Keu等[9]用18F-9-[4-氟-3-（羟甲基）丁基]鸟嘌呤PET分子显像研究过继到体内CD8+毒性T淋巴细胞，把单纯疱疹病毒1 型胸苷激酶作为酶报告基因标记到IL-13Rα2 CAR-T 中，该方法能准确地监测CAR-T细胞活力、生物分布、运输过程等。

3.2 表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（epidermal growth factor receptor variant type Ⅲ，EGFRvⅢ）靶向CAR-T EGFR 是一种酪氨酸激酶受体，在许多肿瘤中表达失调。EGFRvⅢ是最多见的突变体，缺乏与胞外配体相结合的结构域，因此，该酪氨酸激酶受体不再依赖配体，可以持续激活多条下游的信号通路（如PI3K、Ras 等），从而引起肿瘤细胞增殖、血管新生、侵袭等一系列反应[10]。EGFRvⅢ在约30%的GBM 中呈阳性表达，而在正常组织中无表达，因此成为治疗GBM的安全可行的有效靶点。

Morgan 等[11]开发了第三代EGFRv Ⅲ靶向性CAR-T，以CD28-41BB-CD3ζ作为T 细胞信号传导结构域，可特异性识别GSCs 和胶质瘤细胞系，并对培养的正常组织细胞无影响。在GBM模型小鼠中，EGFRvⅢ靶向性CAR-T 可以有效通过BBB 到达肿瘤区，表现出抗肿瘤功效[12]。郑岩等[13]也成功构建了第三代EGFRvⅢ靶向性CAR-T，对EGFRvⅢ阳性U87 胶质瘤细胞有特异杀伤效果。O'Rourke 等[14]首先进行EGFRvⅢ靶向性CAR-T的临床试验，静脉输注EGFRvⅢ靶向性CAR-T 治疗复发性GBM 共10例，部分病人出现肿瘤外毒性和细胞因子释放综合征，中位生存期为8 个月，1 例无进展生存期达到18个月以上。大多数EGFRvⅢ阳性GBM 在复发时维持EGFRvⅢ阳性，而一部分病人却发生变化，因此对于接受EGFRvⅢ靶向治疗的GBM病人，建议重复活检并重新评估EGFRvⅢ状态[15]。目前，EGFRvⅢ靶向性CAR-T 治疗复发性GBM 疗效和安全性的临床试验（NCT02209376、NCT01454596）仍在进行中。

3.3 人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）靶向CAR-T HER2 是一种跨膜糖蛋白，属于EGFR 家族，HER2 致癌基因存在于编码HER2 蛋白的17 号染色体的长臂，可以通过多个信号通路影响细胞增殖和凋亡。HER2 表达与GBM的预后有着密切关系[16]，因此，HER2是GBM病人CAR-T 治疗的另一个重要靶点。但是有案例报道显示，1例转移性肠癌接受CAR-T疗法后死亡，原因是CAR识别肺上皮细胞中低水平表达的HER2所致，因此其安全性受到关注[17]。

Ahmed等[18]通过编码HER2的逆转录病毒载体，转导活化T 细胞获得HER2 靶向性CAR-T，发现HER2 靶向CAR-T 可杀死HER2 阳性GBM 细胞和CD133阳性干细胞，具有显著抗肿瘤活性。HER2靶向CAR-T 的一期临床试验（NCT01109095）已经完成[19]，17例均是HER2阳性复发性或进展性GBM，通过静脉给予HER2靶向CAR-T，1例出现超过9个月的部分反应，7例具有8周至29个月的无进展期，治疗后和诊断后的中位生存期分别为11.1 个月、24.5个月，试验未观察到剂量限制性毒性，2 例出现2 级癫痫和/或头痛。

3.4 酪氨酸蛋白激酶受体2（ephrinA2 receptor EphA2）靶向CAR-T EphA2 在许多肿瘤中过表达，EphA2与相应的配体结合后通过Ras/ERK和PI3/Akt途径调节细胞增殖及凋亡。EphA2 在大部分GBM中呈过表达，并且与预后相关，使其成为治疗GBM的极具吸引力的靶点[20]。

Chow 等[21]研究发现EphA2 靶向CAR-T 可以诱导产生γ-干扰素和白细胞介素（interleukin，IL）-2，对肿瘤细胞具有显著的细胞毒性；12只模型小鼠颅内注入2×106个EphA2 靶向CAR-T 后，生物发光成像显示肿瘤信号明显减弱，小鼠存活时间延长；降低输入的EphA2 靶向CAR-T 细胞数后也发现了抗肿瘤效应，但是通过静脉途径输入方式未观察到抗肿瘤作用。有学者对EphA2特异性CAR进行修饰，获得优化的EphA2靶向CAR-T，抗肿瘤活性增加了20倍[22]。 EphA2 靶 向 CAR- T 的 临 床 试 验（NCT02575261）已经完成，目前未公布试验数据。

4 CAR-T治疗GBM面临的挑战与方向

4.1 抗原异质性与抗原逃逸GBM 抗原异质性是免疫治疗耐药的主要原因。IL-13Rα2 靶向CAR-T 和EGFRvⅢ靶向CAR-T 治疗后均发现靶向抗原的丢失，肿瘤进展[4，15]。有学者设计了HER2和IL-13Rα2的双靶点CAR-T，发现具有更有效的识别肿瘤能力和更加持久的抗瘤活性[23]。目前，已经研究出三价CAR-T，可以克服抗原异质性，并改善治疗效果[24]。4.2 肿瘤微环境 肿瘤微环境存在很多因素抑制T细胞的应答，为了应对微环境产生的免疫抑制因子，例如TGF-β、IL-6、IL-10、IL-23等，一种方法是开发小分子抑制剂和相应的抗体。GBM 会累积许多抑制性白细胞，如调节性T 细胞、髓样抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞等，用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中和髓样抑制细胞，通过节律化疗、阻断CD25 等方法抑制调节性T 细胞作用。目前，免疫检查点抑制剂可明显提高免疫治疗的效果[25]。

4.3 安全性与BBB CAR-T 的毒性主要包括肿瘤溶解综合征、细胞因子释放综合征、神经毒性、靶标毒性等，安全性是免疫治疗首要考虑的。目前，有研究将分子开关、自杀基因导入到CAR 中，增强CAR-T的安全性。为预防“细胞因子风暴”，有学者用化学分子开关将CAR 的抗原识别部分和信号传导部分分开，只有在小分子配体（AP21967）存在时被激活[26]，如此依据AP21967的剂量和作用时间来调节T细胞的毒性和细胞因子的释放。BBB的存在使通过外周血进入肿瘤的效应T细胞不足10%，是限制CART疗效的重要原因。提高BBB的通透性和改变输注途径可以明显改善抗瘤效应[7]。

综上所述，CAR-T疗法给GBM治疗提供了一个新的研究方向，但是仍需要进一步研究GBM的分子机制，寻找最优的靶点，设计更多靶点、通用型、增强型的CAR-T，以及联合其他治疗方法。