前列腺癌早期诊断及术后检测试剂盒的研发*

陈胜辉，刘居理，陈伊，蒋祥龙，饶研文（南昌市生殖医院，江西 南昌330006）

前列腺癌是男性生殖系统常见的恶性肿瘤，在欧美前列腺癌是男性癌症死亡的主要原因之一［1］。据统计，前列腺癌的发病率在北欧各国占男性肿瘤的第一位，目前北欧前列腺癌的发病率已经超过美国，成为威胁男性健康的第一位肿瘤。近年来，我国的前列腺癌发病率明显增加［2］。流行病学数据显示，我国前列腺癌的发病率已在所有肿瘤中居第十位，引起高度关注。前列腺癌的发病与年龄呈正相关，年龄越大，发病率越高。发病比较隐匿，症状容易和其他良性前列腺疾病如前列腺肥大等混淆，疾病的进展比较缓慢。在我国，由于对前列腺癌的认知程度比较低，没有作定期体检，因此很多病人都是到晚期出现症状以后才就诊。

目前，前列腺癌的诊断和术后随访主要依靠血前列腺特异性抗原检查，但其敏感性低，尤其在肿瘤的早期。除前列腺癌以外，许多因素均能导致血清PSA升高，包括泌尿系统感染、直肠或尿道内检查、尿潴留等［3］。文献报道，PSA诊断前列腺癌的敏感性为43%～81%，特异性为59%～93%。尤其是tPSA值介于4.0ng/ml～10.0ng/ml之间的灰区时，其对前列腺癌的特异性显著下降，仅大约25%左右为前列腺癌［4］。针对前列腺癌早期诊断存在的不足，急需研发一种灵敏度高、准确性强的前列腺癌早期诊断试剂盒。本文拟通过分析尿外泌体中前列腺癌标志物CA9和Survivin与前列腺癌的关系，旨在研发出一种灵敏度高、准确性强的前列腺癌早期诊断并可适用于前列腺癌术后随访的试剂盒。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月～2020年6月我院收治的前列腺癌患者50例为观察组，选取同期收治的前列腺增生患者30例为对照组，选取健康志愿者20例健康组。观察组年龄69.0±6.3岁；对照组年龄69.2±6.2岁；健康组年龄68.9±6.4岁。三组实验对象的年龄资料比较，无显著差异（P＞0.05），具有可比性。本研究经我院伦理委员会批准。

1.2 观察组纳入与排除标准 纳入标准：（1）未给予激素治疗、放疗或手术治疗；（2）所有研究对象均签署知情同意书。排除标准：（1）非原发病灶的转移前列腺癌患者；（2）经手术、放化疗治疗后存活5年且病情稳定的前列腺癌患者；（3）严重肝肾功能异常的患者。

1.3 方法

1.3.1 尿液标本收集 收集上述研究对象晨尿30ml，离心后弃去沉渣，留取尿液上清，-80℃储存，用于后续提取外泌体。

1.3.2尿外泌体的提取 将上述尿液上清解冻并离心，取10ml尿液上清进行外泌体的提取，提取方法按ExoQuick试剂（System Biosciences公司）说明书进行。

1.3.3 外泌体RNA的提取 尿液外泌体RNA的提取采用miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒（QIAGEN公司），根据试剂盒说明书的操作步骤进行RNA的抽提，所得总RNA经浓度测定后用于RT-PCR。

1.3.4 CA9和Survivin的RT-PCR检测 取上述提取的RNA为模板，采用PrimeScriptTM逆转录试剂盒（TAKARA公司）进行cDNA的合成，实验步骤按说明书进行。分别取8μl cDNA为模板，采用20μl反应体系，以β-actin作为内参，按照SYBRPremix Ex TaqTMII PCR试剂盒（TAKARA公司）要求进行实时荧光定量PCR检测外泌体中CA9和Survivin表达与否。其中CA9的引物为F：GGACAAAGAAGGGGATG ACC；R：AGTTCTGGGAGCGGCGGGA。Survivin的引物为F：TCTGGCGTAAGATGATGGA；R：CACAGCAGTGTTTGAAATGAC。β-actin的引物为F：AGCGGGAAATCGTGCGTG；R：CAGGGTACATGGTGGTGCC。反应条件如下：95℃10min预变性，95℃15s，60℃1min，40个循环。

1.4 统计学处理 数据采用SPSS 19.0统计学软件进行处理。计量资料采用±s表示，行t检验；计数资料采用例（百分率）表示，行χ2检验。P＜0.05示差异有统计学意义。

2 结果

观察组中有41例尿外泌体中检测出CA9或Survivin，其中CA9阳性30例，Survivin阳性34例。对照组及健康组未检测出CA9或Survivin。观察组CA9和Survivin的检出率显著高于对照组、健康组，差异有统计学意义（P＜0.05），对照组CA9和Survivin的检出率与健康组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；单独采用CA9对前列腺癌患者进行检测其检出率为60.0%，单独采用Survivin对前列腺癌患者进行检测其检出率为68.0%，而采用CA9联合Survivin对前列腺癌患者进行检测其检出率为82.0%。

3 讨论

当前，寻找尿液中标志物来早期发现或诊断前列腺癌是国内外研究的热点，以期减少或替代创伤性检查。前列腺癌肿瘤标志物一直是前列腺癌研究的一个重点，到目前为止，用的最多还是前列腺特异性抗原（PSA），但光靠这个经典指标或多或少存在敏感性不高，假阳性率和假阴性率过高的问题，无法取代前列腺穿刺活检。液体活检领域是一个很有潜力的领域。随着研究发现的不断积累，越来越多的疾病将可以使用体液检测来实现诊断和监控。液体活检主要包括血液中的循环肿瘤细胞、游离DNA、外泌体等。其中外泌体发现比较新，虽然发展迅速，但医院还未见外泌体的诊断试剂盒出现。

外泌体是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，一直被认为是一种细胞废弃物［5］。最近发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其它细胞从而影响其它细胞的功能，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等［6］。不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物［7］。最新研究表明，尿上清中有大量从癌细胞分泌出来的外泌体，这些外泌体含有大量RNA或DNA标记物。因此，检测尿液中外泌体DNA或RNA标记物有望为前列腺癌的诊断提供一个新方法。生存素（Survivin）基因是一种重要的凋亡抑制基因，它有独特的分子结构及生物学功能［8］。在细胞凋亡、细胞周期的调节和血管形成中有着关键作用［9］。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成员，研究表明在正常组织中无表达，但在多种肿瘤组织中高表达，且与肿瘤进展和术后判断有关，在前列腺癌中有较多研究。Survivin在前列腺癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级表达分别为55%、75%、81%。说明恶性程度越高Survivin表达越丰富［10］。碳酸酐酶9（Carbonic anhydrase 9，CA9）属于碳酸酐酶的成员，主要功能为调节PH和维护正常生理功能［11］。CA9为近年来新发现的肿瘤标记物。CA9在肿瘤的表达主要是由于缺氧而导致HIF1X升高后引起CA9的表达增加，研究表明CA9是前列腺癌一个新的标记物［12］。目前国内外尙无CA9和Survivin诊断前列腺癌的专门试剂盒，而当前我国肿瘤诊断试剂行业比较落后，产业化的项目还是那些常见的肿瘤标志物，急需开发一些新肿瘤标志物并进行产业化。本研究表明，可以通过检测尿外泌体中的CA9和Survivin来辅助诊断前列腺癌及用于术后随访，具有较好地敏感性及特异性。

综上所述，若能将CA9和Survivin作为标志物进行试剂盒的组装应用于前列腺癌的早期诊断及术后随访具有一定的应用前景。