泛素水解酶22对舌鳞癌细胞侵袭与迁移的影响

刘起 冯元勇 葛胜优 尚伟

(1 青岛大学附属医院口腔颌面外科，山东 青岛 266003； 2 高密市人民医院口腔科)

口腔鳞癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，其中舌鳞癌是最常见的口腔肿瘤[1-2]。治疗方式主要有手术以及放化疗，患者5年的生存率约为50%[3-4]。泛素水解酶-22(USP-22)是泛素特异性加工酶家族的成员，主要参与调节细胞周期以及激活基因转录等过程，与食管癌、胃癌等多种肿瘤的发生密切相关[5-8]。但是USP-22基因与舌鳞癌生物学行为的相关性报道较少。本研究通过对临床舌鳞癌患者肿瘤组织中USP-22和ERK5蛋白的表达情况进行检测，并探讨siRNA-USP-22沉默质粒对人舌鳞癌细胞系细胞侵袭与迁移能力的影响，以期为临床上舌鳞癌的治疗提供新的靶点。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1

人舌鳞癌细胞系TCA8113 细胞及 Tb 细胞均购买自中国科学院上海细胞库。胎牛血清(以色列BI公司)；逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)；Real-time PCR仪(美国Bio-Rad公司)；CCK-8试剂盒以及Transwell试剂盒(美国Invitrogen公司)。

1.2

选取2014年2月—2019年7月青岛大学附属医院口腔颌面外科手术切除的21例舌鳞癌患者(男11例，女10例)的肿瘤组织和癌旁组织标本，将标本置于含体积分数0.10的甲醛溶液中，Bouin氏固定液固定，乙醇脱水后制备成蜡块，-80 ℃冰箱保存备用。

1.3

将收集到的舌鳞癌组织和癌旁组织标本，根据病理检测结果分为癌旁组织(对照组)21例，舌鳞癌高分化组(高分化组)11例及舌鳞癌中低分化组(中低分化组)10例。对所有标本按照试剂盒说明书进行HE染色和免疫组织化学染色处理，于倒置光学显微镜下观察染色结果。

1.4

先将人舌鳞癌细胞系TCA8113 细胞以及Tb细胞接种于6孔板中，待细胞融合率达60%以上时弃掉含10% FBS的DMEM培养基，加入无血清的DMEM培养基，给予去极化处理，取对数生长期的细胞用于实验。

1.5

利用PubMed基因库筛选USP-22基因序列，设计USP-22基因扩增序列，以环状RNA为载体，构建沉默该基因的siRNA质粒，慢病毒包装后进行后续舌鳞癌细胞的转染。根据是否转染质粒，将细胞分为TCA8113细胞对照组(A组)、TCA8113细胞未转染组(B组)、TCA8113细胞转染组(C组)及Tb细胞对照组(D组)、Tb细胞未转染组(E组)、Tb细胞转染组(F组)。C组和F组细胞给予慢病毒包装的siRNA质粒进行转染，感染复数为50，慢病毒滴度为3×1010U/L，B组和D组细胞给予慢病毒包装的空白质粒转染，A组和C组细胞给予等量PBS溶液作为对照。

1.6

将经慢病毒包装的质粒处理72 h后的A～F组细胞离心，接种于6孔板中，使用无菌10 μL枪头画一宽0.5 mm的划痕，加入不含FBS的DMEM培养基，分别于0 和12 h在倒置光学显微镜下观察细胞的迁移距离。实验重复3次，取均值。

1.7

将A～F组细胞按照Transwell试剂盒的说明书要求，配置基质胶，与预冷的DMEM培养基混合，加入结晶紫染色试剂孵育，在倒置光学显微镜下观察各组侵袭细胞数量。实验重复3次，取均值。

1.8

2 结 果

2.1

染色结果显示，对照组组织内未见癌巢及角化珠(图1A)；高分化组癌巢与周围组织界限清楚，可见癌巢和角化珠(图1B)；中低分化组癌巢与周围组织无明显界限，无明显角化珠(图1C)。

A：对照组，B：高分化组，C：中低分化组，200倍

2.2

免疫组织化学染色结果显示，对照组、高分化组以及中低分化组中USP-22蛋白的表达量分别为1.014±0.001、1.110±0.023、1.131±0.010，ERK5蛋白的表达量分别为1.143±0.007、1.201±0.014、1.208±0.009，3组间两种蛋白的表达量比较差异均具有显著性(F=377.72、211.29，P<0.05)，其中高分化组和中低分化组中USP-22蛋白和ERK5蛋白的表达量与对照组比较差异均具有显著意义(q=22.72～34.13，P<0.05)，高分化组中USP-22蛋白的表达量与中低分化组比较，差异具有显著性(q=5.39，P<0.05)。

2.3

A、B和C组细胞的迁移距离分别为(92.47±2.02)、(98.46±10.48)和(63.34±12.10)μm，3组细胞迁移距离比较差异具有显著意义(F=12.21，P<0.05)，其中C组细胞的迁移距离明显短于A、B组(q=5.41、6.53，P<0.05)。D、E和F组细胞的迁移距离分别为(92.72±2.93)、(93.48±3.95)和(73.15±6.45)μm，3组细胞迁移距离比较差异具有显著性(F=18.17，P<0.05)，其中F组细胞迁移距离明显短于D、E组(q=7.24、7.52，P<0.05)。

2.4

A、B和C组侵袭细胞的数量分别为(61.33±3.81)、(59.31±3.07)和(36.03±4.15)个，3组细胞侵袭能力比较差异具有显著意义(F=43.22，P<0.05)，其中C组细胞的侵袭能力明显低于A、B组(q=11.83、10.89，P<0.05)。D、E和F组侵袭细胞数量分别为(99.18±2.18)、(98.32±2.61)和(69.87±10.69)个，3组细胞侵袭能力比较差异具有显著性(F=19.90，P<0.05)，其中F组细胞侵袭能力明显低于D、E组(q=7.84、7.61，P<0.05)。

3 讨 论

舌鳞癌是临床上常见的口腔肿瘤，目前针对舌鳞癌仅局限于手术切除肿瘤并结合放化疗进行综合治疗，对于晚期的舌鳞癌患者，手术效果欠佳，5年生存率较低[9]。因此，需要寻找更为准确的分子标志物，从而做到早期诊断和早期治疗，这对提高患者的预后非常重要。

USP-22是泛素蛋白特异性蛋白酶家族中的一员,属于去泛素酶家族。泛素特异性蛋白酶是去泛素酶家族中最大且最具特异性的亚家族,具有物种和组织特异性,其核心催化域约由350个氨基酸组成。既往研究认为，USP-22与人宫颈癌细胞上皮-间质转化功能密切相关[10]。研究发现，USP-22基因可以通过Sirt1/JAK/STAT3信号通路介导非小细胞肺癌的增殖和侵袭能力[11-12]。USP-22基因还可以介导胰腺癌的自噬过程，USP-22基因敲除实验显示，其可以通过促进自噬抑制吉西他滨诱导的胰腺癌细胞凋亡[13-14]。ERK5信号通路是MAPK信号通路中的一员，可以参与细胞的增殖、凋亡和侵袭等过程[15-17]。既往研究表明，ERK5蛋白的差异性表达与前列腺癌的增殖以及侵袭密切相关，并且ERK5的过度表达可以促进前列腺癌的转移[18-19]。也有研究发现，ERK5也与非小细胞肺癌和骨肉瘤等肿瘤的侵袭和转移密切相关[20-21]。同时ERK5蛋白在食管鳞癌组织中具有差异性表达的特点，可以作为分子标志物。但是，USP-22和ERK5在舌鳞癌发生中的作用鲜有报道。因此，本研究应用免疫组织化学染色的方法检测舌鳞癌患者的癌旁组织、高分化以及中低分化舌鳞癌组织中USP-22和ERK5蛋白的表达，结果显示，高分化组和中低分化组中USP-22和ERK5蛋白的表达量均显著高于对照组，相较于癌旁组织，高分化和中低分化舌鳞癌组织中可以检测到USP-22和ERK5的高表达，提示USP-22和ERK5可以作为舌鳞癌的生物标志物，对其早期诊断和早期治疗起到一定的提示作用。

为进一步揭示舌鳞癌细胞的侵袭与迁移机制，本研究选取了两种舌鳞癌细胞系，即人舌鳞癌细胞系TCA8113细胞及Tb细胞作为研究对象，应用细胞划痕实验和Transwell实验检测siRNA沉默质粒对上述两种细胞的侵袭与迁移能力的影响。结果证明，siRNA沉默质粒沉默USP-22基因表达后，可以有效抑制舌鳞癌细胞的侵袭与迁移。

综上所述，USP-22与ERK5可以作为舌鳞癌早期诊断的生物标志物，siRNA-USP-22沉默USP-22基因表达后可以有效抑制人舌鳞癌细胞的侵袭与迁移能力。但本研究中临床样本例数较少，而且侵袭与迁移能力的测试均是进行的体外细胞实验，后续应该加大样本量以及进行相关的临床试验，为临床提供更加真实可靠的参考数据。