人乳活性成分—骨桥蛋白研究进展

朱 婧 综述 汪之顼 陈同辛 审校

1.北京市科学技术研究院北京市营养源研究所（北京 100069）；2.南京医科大学公共卫生学院儿少卫生与妇幼保健学系（江苏南京 211166）；3.上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心免疫科（上海 200127）

母乳可提供婴儿生长发育所需的营养物质和活性成分，特别是一些与免疫保护密切相关的功能成分，包括蛋白质类，如乳铁蛋白（lactoferrin）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）；脂类，如1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯（1,3-dioleoyl-2-palmitoyl triglyceride，OPO）、乳源神经节苷脂（gangliosides milk origin，gsMO），以及母乳低聚糖（human milk oligosaccaride，HMO）等。OPN是近年来备受关注的一种高度磷酸化，具有O-糖基化修饰的酸性蛋白质。人乳中富含分泌型OPN，是重要的生物活性成分。近年来的研究发现人乳OPN在生命早期的肠道生长、免疫调节、神经系统发育等方面发挥着重要作用，因此也称为OPN活性蛋白。OPN与其他人乳活性成分，如OPO、gsMO等构成的免疫保护效应也逐渐引起学者关注。本文就乳汁中OPN 对生命早期婴幼儿生长发育和健康作用作一介绍。

1 乳汁中的OPN

OPN曾被称为骨唾液酸糖蛋白1（bone sialoprotein 1，BSP-1），由位于4 号染色体q 13 的单一拷贝基因SPP 1 编码，人乳中的OPN 由298 个氨基酸组成。OPN含有以谷氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）为特征的特殊结构序列，RGD序列是促进细胞黏附蛋白质的特有结构。人乳OPN 的相对分子质量约44 000，其大小取决于其翻译后的修饰程度[1]。人乳OPN 的翻译后修饰以高度磷酸化和糖基化修饰为主要特征，包括36个磷酸化位点和5个O-糖基化位点，磷酸化位点占有率在不同泌乳时期存在差异。由于O-聚糖的末端存在唾液酸化，OPN也被称为唾液酸糖蛋白。研究表明，糖基化可以影响磷酸化，还可以影响OPN的细胞黏附活性[2]。

OPN可由体内多种组织细胞合成或分泌，广泛存在于骨、肾、脑、肌肉等多种组织和细胞中，包括存在于体液中的分泌型OPN和免疫细胞中的细胞内OPN。近些年的研究发现，乳汁尤其是初乳中分泌型OPN的含量非常高，是重要的人乳活性成分[3]。3 月龄婴儿血浆和脐带血浆中OPN的浓度分别为342 ng/mL、263 ng/mL，是成人血浆OPN 浓度（35 ng/mL）的7～10 倍。随着婴儿月龄增加，人乳中OPN 的含量呈逐渐下降趋势[4]。研究发现，人乳OPN 含量在不同国家和个体间具有较大差异，中国母亲人乳中OPN 含量（266.2 mg/L）明显高于韩国（216.2 mg/L）、日本（185 mg/L）和丹麦（99.7 mg/L）母亲；另外，中国母亲人乳OPN 占总蛋白的比例（2.7%），也高于韩国（1.8%）、日本（2.4%）和丹麦（1.3%）母亲[4]。同一国家不同母亲乳汁中OPN含量差异也比较大。导致乳汁中OPN含量差异的原因尚不清楚，可能是种族和环境（饮食、地理因素等）共同影响所致[4]。

不同物种乳汁中的OPN 含量也存在巨大差异。人乳OPN 平均浓度（138 mg/L），明显高于牛乳（18 mg/L），以牛乳为基础的未强化OPN的婴儿配方粉中的OPN含量也很低[3]。在氨基酸序列、磷酸化和糖基化修饰位点等方面，牛乳和人乳OPN具有许多相似性。牛乳OPN 含有262 个氨基酸，其中182 个氨基酸与人乳OPN 相同（61%），另外还有44 个氨基酸具有高度的结构相似性。此外，牛乳OPN也同样具有磷酸化和O-糖基化的翻译后修饰，且具有相同的RGD序列。不同的是，与人乳OPN相比，牛乳OPN的磷酸化位点和O-糖基化位点较少，分别为28个和3个，但其中25个磷酸化位点以及所有的O-糖基化位点均与人乳OPN相同[1-2]。

OPN 在脐带血、婴儿血浆、乳汁尤其是初乳中的含量非常高，提示OPN对生命早期的生长发育和健康具有非常重要的意义。人乳中的OPN 以完整或OPN多肽的状态混合存在。人乳中天然存在的蛋白酶，如纤溶酶、基质金属蛋白酶、凝血酶和组织蛋白酶D等，可水解OPN 产生不同的OPN 多肽，这些多肽可以与一系列整联蛋白结合发挥不同功能[1]。牛乳OPN 与人乳OPN 具有相似性，也可在蛋白酶的作用下产生具有整联蛋白结合作用的OPN 多肽[1,5-7]。进入肠道后，OPN 可以部分耐受消化酶、胃酸的分解，完整的OPN 或OPN 多肽进入肠道后被吸收，发挥生物学作用[5-7]。目前有关乳汁OPN相关研究涉及早期肠道生长、免疫调节、髓鞘化等[8]。

2 OPN与肠道增殖和成熟以及肠道微生态

完整或部分消化的OPN 可与肠上皮细胞细胞膜上的受体结合，激活细胞信号通路，从而在肠道内发挥多重功能。在对经OPN 基因敲除处理后母鼠及其所产仔鼠的研究中，将母鼠及仔鼠随机分为，OPN基因敲除母鼠照护组、野生型母鼠照护组和OPN 基因敲除母鼠照护同时联合牛乳OPN 喂养组（bmOPN），bmOPN 组每天补充牛乳OPN（浓度12 μg/g）；仔鼠喂养10天后取小肠，发现bmOPN组和野生型母鼠照护组仔鼠的小肠绒毛高度以及隐窝深度均显著高于OPN 基因敲除母鼠照护组仔鼠，说明OPN 能刺激人隐窝状上皮细胞的增殖，有助于促进仔鼠小肠黏膜的生长发育，增加小肠黏膜表面积，且牛乳OPN与鼠乳OPN 对仔鼠有同样的效应[9]。鉴于OPN 结合位点在不同物种间保守，牛乳OPN对人类婴儿也可能发挥其生物活性。

在对牛乳OPN 增强肠道细胞增殖的潜在机制研究中，采用微阵列分析（illumina）显示，牛乳OPN 可显著修饰与细胞增殖和免疫功能密切相关的基因，如MAPK 13、CCNE 1、CdGAP、CXCL 10、IL 6 ST 和NFκB，OPN可通过整合素信号通路调控小肠基因表达，通过整联蛋白受体结合和增殖来调节细胞迁移和细胞趋化性，从而说明OPN对新生儿肠道增殖和成熟的直接作用[9]。还有研究显示，牛乳OPN可通过肠道上皮细胞（Caco-2）上调IL-18分泌，从而增强肠上皮细胞（Caco-2）的分化并刺激肠道免疫功能[10]。此外，新生恒河猴分别给予恒河猴乳、普通配方以及添加OPN配方（125 mg/L）喂养3个月，比较各组婴猴的空肠转录组，结果显示添加OPN 配方组的空肠转录组与恒河猴乳组更相似，说明OPN可通过整合素和CD44受体刺激涉及细胞增殖、迁移、存活和信号通路的基因表达[11]。

OPN 在维持肠道黏膜完整中也起着至关重要的作用。在以葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）诱导急性结肠炎小鼠模型中，OPN 基因敲除鼠比对照鼠的肠黏膜炎症活动指数加重，且肠黏膜中occludin蛋白表达减少，而occludin蛋白是保证细胞间紧密连接的重要成分，是维持肠黏膜完整性的重要因素[12]。动物研究还显示，OPN可以通过调节免疫反应来减轻大肠杆菌黏多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的小鼠肠道炎症[8-9]。

研究发现，OPN还可以改变肠道菌群而影响肠道微生态。接受牛乳OPN喂养的仔猪肠腔中丙酸、戊酸和异丁酸的相对比例变化明显[13]。此外，在对早产猪的研究中还发现，OPN有减低剖宫产早产仔猪的坏死性小肠结肠炎的发生率的趋势，同时疾病严重度明显减轻[14]。

3 OPN与免疫发育

OPN在多种免疫细胞中分泌，比如活化的T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和巨噬细胞，被认为是一种细胞因子样分泌蛋白。分泌型OPN 和细胞内OPN都在免疫调节中发挥重要作用。

早在1998 年就有研究发现，OPN 注入大鼠真皮质，可以诱导巨噬细胞向注射处聚集，且积聚的细胞表面大都高表达OPN受体，且这种局部浸润作用可被抗OPN中和抗体明显抑制。2009年研究发现，单核细胞表面高度表达的αXβ2整合素（CD11c/CD18）是一种新型OPN 受体，分泌型OPN 与其结合后可以发挥调节巨噬细胞趋化、黏附、浸润和吞噬的作用，阐明了OPN 在固有免疫中的重要功能。OPN 还可促进树突状细胞（dendritic cells，DCs）的激活、迁移，有利于DCs从外周向次级淋巴器官迁移；OPN诱导 DCs表达人白细胞DR抗原（HLA-DR），使得DCs刺激能力增强。此外，OPN还可通过与 CD44和整合素受体的相互作用，调控 DC细胞从表皮向淋巴结回流。同时，在1998年就发现OPN 可能在促进B 细胞增殖和分化以及自身抗体产生中起重要作用。OPN首先刺激产生抗CD3抗体，进而诱导T细胞产生CD40L和IFN-γ，增强T、B细胞之间的作用，在调节体液免疫应答中发挥重要作用。研究还发现，细胞外基质OPN可通过将肥大细胞限制在炎症部位并抑制IgE诱导的肥大细胞因子释放来调节适应性免疫[1,7,15]。

临床随机对照研究也显示OPN 对婴儿免疫的调节作用。在一项随机对照试验中，纳入240 例1～6 月龄配方喂养健康足月儿，随机分为标准配方组（SF）和添加牛乳OPN 配方组，分别添加OPN 65 mg/L 或130 mg/L（F65，F130，人乳平均OPN浓度的50%和100%），另设置母乳喂养对照组（BF，80例）；评估各组婴儿在1、4、6 月龄时的生长发育、健康状况及血生化指标；结果显示，添加牛乳OPN 配方组（F 65，F 130）均具有良好的耐受性，婴儿体格生长与SF 组无差异；F 130 组与SF 组相比，婴儿发热减少；同时，F 130 组的血浆苏氨酸及支链氨基酸水平低于SF 组及F 65 组，更接近BF 组；F 65 组和F 130 组的促炎细胞因子TNF-α 显著低于SF 组[16]。进一步研究显示，F 130 组的外周血T 细胞和单核细胞比例高，更接近BF 组，显示OPN 在生命早期免疫调节方面的效应[17]。

4 OPN与神经系统

除了对生命早期肠道增殖和成熟、免疫发育的作用，OPN对生命早期神经系统发育也有重要作用。小鼠研究显示，OPN通过促进髓鞘形成而在生命早期大脑发育和行为发育中发挥重要作用。将新生小鼠分组后，分别由OPN敲除母鼠（OPN敲除母鼠乳汁中无OPN）及对照母鼠喂养，出生第6天和第8天时，OPN敲除组小鼠大脑OPN水平显著下降；同时对照组小鼠髓鞘相关蛋白的表达增加，NG-2 胶质细胞向少突胶质细胞增殖和分化增强，并伴随着ERK-1/2和P13K/Akt信号转导的增加；行为测试显示OPN敲除组小鼠的记忆力和学习能力受损[18]。

对仔猪的研究也得出了类似的结论，将21 只产后第2 天的仔猪随机分为大豆分离蛋白标准代乳品喂养的对照组（11 只）、相同饮食强化OPN 的试验组（10只），喂养至出生34天，并在28～32天时进行认知测试和大脑磁共振成像以评估大脑发育。结果发现，两组仔猪的认知测试并未表现出明显差异，但OPN组仔猪的胼胝体、侧脑室、左右内囊、左右苍白球、右海马和右大脑皮质的体积均显示大于对照组，提示OPN影响仔猪脑结构发育，并对仔猪的行为有一定的影响[13]。

综上，OPN 作为重要的母乳活性成分，在生命早期的生长发育和健康中发挥重要作用，如促进肠道增殖和成熟、免疫发育和调节、神经发育等。随着对人乳活性成分的研究扩展和深入，多种母乳活性成分的联合应用已成为婴儿配方食品的主流发展方向。OPN与母乳中的其他活性成分，如gsMO、OPO等组合，通过不同机制共同作用，帮助婴幼儿从局部肠道到全身免疫，构建立体免疫保护系统。