宏基因二代测序在肺部感染中的应用及优化

冯玲，熊佳丽，高燕，易荣，陈雀飞，刘毅

(中南大学湘雅医学院附属株洲医院呼吸与危重症医学科，湖南 株洲 412007)

肺部感染是指由各类病原体引起的终末气道、肺泡和肺间质感染，常表现为咳嗽、咳痰、发热、气促等，是发病率及病死率均较高的一种感染性疾病[1-2]。随着临床癌症治疗、器官移植中免疫抑制剂的使用以及艾滋病等所致免疫受损患者的增多，肺部感染人群也有增高趋势。早期精准的抗病原学治疗，可帮助医师及时优化抗菌及抗病毒药物的使用，提高用药的有效性，改善患者的预后。而传统微生物检测方法(培养、涂片等)难以满足目前的临床需求，尤其在处理复杂病原体感染时，存在周期长、准确性有限等缺点，导致诊断延迟或疏漏等[3]。近年来，宏基因二代测序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)技术为肺部感染的病原学诊治提供了新视角。mNGS可直接将提取标本中的全部核酸片段进行检测，再经生物信息学分析鉴定出标本中所含核酸的种类，获得病原体的序列数、覆盖度等定量分析数据。与传统检测方法相比，mNGS无需培养，病原覆盖度广、灵敏度高，且利于发现新的病原体[3-4]。mNGS快速识别病原体的能力，可帮助临床医师及时调整治疗方案，提高疾病治愈率，降低病死率。现就mNGS在肺部感染中的应用及优化予以综述。

1 mNGS在肺部感染中的应用

1.1细菌及真菌感染 细菌是常见的肺部感染病原体之一。研究表明，与培养法相比，利用mNGS检测常见菌的敏感性无显著优势，但检测厌氧菌、真菌等的阳性率却相对较高，且受前期使用抗生素的影响较小[4-5]。mNGS可用于罕见社区性获得性肺炎病原体的早期鉴定，而鲍曼不动杆菌是医院获得性肺炎的常见菌，在社区获得性肺炎中少见。Xu等[6]对收治的1例严重的社区获得性肺炎患者的血及痰标本进行mNGS检测，快速鉴定为鲍曼不动杆菌感染，这是第1例在mNGS的协助下及时诊治的社区获得性鲍曼不动杆菌肺炎。mNGS也可用于混合性肺部感染患者的病原学诊断。Wang等[7]对比了mNGS与常规检测方法在混合性肺部感染中对病原体的诊断性能发现，mNGS检测混合性肺部感染病原体的阳性率显著高于常规检测方法，尤其可提高对真菌的诊断水平，但其特异度相对较低。同时，mNGS还可以帮助医师了解不同人群肺部微生物的分布，便于更精准地识别病菌。Zinter等[8]对41份来自免疫低下人群的下呼吸道样本进行mNGS检测，首次评估了该类人群肺部微生物群的分布，并对比同一样本及不同样本间微生物的差异，结果在45.8%的临床检测阴性标本中识别出了潜在的病原体。随着抗生素使用的增加，病菌对抗生素耐药也成为肺部感染治疗中的难题。而mNGS可对病菌的基因组进行测序，评估耐药基因的多样性及抗性，进而发现新的耐药靶点，且无需将单个菌群分离出来培养再检测，对耐药菌群后期新抗生素的研发具有重要的指导意义[9-10]。在临床实践中，细菌及真菌培养仍是公认的诊断金标准，但某些病菌培养的阳性率较低且容易遗漏。除了在识别常见菌方面无显著优势外，mNGS在识别其他病菌(真菌、厌氧菌及一些潜在病原体等)、诊断混合性肺部感染以及寻找经验性抗菌治疗欠敏感患者的致病病原体方面均有较好的应用价值。

1.2病毒感染 病毒性肺炎好发于冬、春季，可爆发或散发流行，除了常见症状外，严重者(传染性非典型肺炎、中东呼吸综合征以及新型冠状病毒性肺炎等)还会累及全身多个系统，甚至危及生命。因此，对于病毒性肺炎患者，快速、准确地进行诊断、监测是治疗和疾病控制的关键。目前，临床常用的识别病毒的检测手段大多针对已知、常见病毒，难以有效、快速地识别变异和未知的病毒。而mNGS对呼吸道病毒具有较高的灵敏度[11]，可快速检测出已知及未知病毒。Chen等[12]利用mNGS在2例新型冠状病毒性肺炎患者的肺泡灌洗液标本中发现了同一种新的高丰度病原体(β-冠状病毒属)，为后期治疗提供了有力的病原学依据。mNGS同样有助于病毒共感染的鉴定，Li等[13]利用mNGS在1例患有急性呼吸窘迫综合征的成年女性中发现了鼻病毒和博卡病毒共感染，这两种病毒多见于儿童重症肺炎，在成人中少见。mNGS也可用于寻找病毒的起源和自然宿主，从根源处深入了解病毒的特性，预测病毒在人体的潜在致病力[14-15]；还可通过检测完整的病毒基因组实现毒株分型，同时监测病毒基因进化[16-18]，为新治疗方案的制订及疫苗的研制提供参考。另外，mNGS还可为院内感染的实时预防提供信息。Greninger等[19]利用mNGS在13例感染了人副流感病毒3型患者的样本中得到了人副流感病毒3型的全基因组序列，并通过分析短期内连续发生的3例医院获得性人副流感病毒3型感染患者的mNGS结果发现，其中2例的序列是一致的，考虑为同一来源，提醒医务人员潜在院内病原的传播，也为早期干预提供了理论依据。同时，mNGS识别病原体来源的能力也可被用于排除医院获得性感染传播的可能[20]。可见，mNGS不仅能识别新的病毒，还能进行致病力的评估，利于病毒性肺炎的实时监测及预防，在未来新病原体的发现、诊断、分型等方面均具有巨大潜力。

1.3特殊病原体感染 肺结核是常见的传染性疾病，严重危害人类健康。结核病的精准诊断是疾病控制的重要条件，但常规痰检阳性率较低，往往无法明确诊断为肺结核。而mNGS的出现为结核分枝杆菌诊断提供了新途径。Zhou等[21]对菌体培养、结核分枝杆菌/利福平耐药试验、mNGS以及mNGS联合结核分枝杆菌/利福平耐药试验检测结核分枝杆菌的灵敏度进行比较发现，mNGS与结核分枝杆菌/利福平耐药试验的检测效果相当，均较菌体培养好，且mNGS联合结核分枝杆菌/利福平耐药试验检测的灵敏感度更高，但由于结核分枝杆菌与其他分枝杆菌属基因组具有一定相似性，mNGS难以完全鉴别，且检测效率受前期抗结核治疗的影响，阳性率仅为44%。肺孢子虫肺炎通常发生于免疫缺陷患者，是一种严重的机会性感染，由于肺孢子菌负荷量低，使用普通方法检测容易漏诊。Zhang等[22]研究发现，与传统检测方法相比，mNGS具有更高的肺孢子虫肺炎检出率。另外，周燕琳和陈亚娟[23]在多种检测手段均未明确病原体的情况下，使用mNGS对1例肾移植术后的重症肺炎患者进行检测，快速诊断出卡氏肺孢子菌肺炎，为后续调整治疗方案提供了依据。可见，mNGS作为一种有效的诊断方法，可用于免疫缺陷患者。

2 mNGS的局限性

虽然mNGS在肺部感染中应用广泛，但实际应用中仍存在许多局限性。①mNGS易受外源污染干扰，加之呼吸道定植菌的影响，最终影响结果的精准判读[24]。②mNGS具有较高的灵敏度，但特异度相对较低[25]。③高丰度的宿主背景核酸限制了mNGS病原体检测的总体灵敏度[26]，尤其当患者病程中产生强大的免疫反应时，样本中高浓度的炎症细胞会进一步使病原体序列数相对减少[3,27]，影响检测效果。④mNGS对RNA病毒的检测效果较DNA病毒差，一方面由于RNA易降解，另一方面由于DNA病毒可以直接检测，而RNA病毒需逆转录成互补DNA才能进行测序[3，28]。⑤mNGS对于有细胞壁保护的病原体(厚壁真菌、结核菌等)检测效率总体不高，需要加用破坏细胞壁的试剂才能使该类病原体的核酸完全释放出来[29]。⑥目前对mNGS结果的判读尚缺乏公认的标准，数据库也还需进一步完善(尤其针对未知病原体及新型耐药基因)。⑦mNGS的价格较传统检测方法高，对于病情反复的患者，难以实现多次检测。虽然mNGS检测病原体的灵敏度较高，但目前还不能完全取代传统检测方法，其临床应用也还需进一步优化。

3 mNGS的优化应用

3.1患病人群的选择 对于常见病原体感染、临床及影像学表现典型、有特定怀疑病原体的肺部感染患者，传统的微生物检测技术(培养、涂片等)相对更经济、实用，且能实现多次复检的需求；而对于临床病症及影像学表现复杂、现有技术无法明确、罕见或不典型病原体感染、混合性感染可能性大、对标准化抗菌治疗无效且原因未明或危重症患者需尽早明确病原体的患病人群，mNGS的优势更显著[30-32]，针对这部分人群可以优先考虑使用mNGS。

3.2标本的选择 与传统检测方法相比，mNGS价格较高，难以实现多次、多处标本的送检，因此有必要针对性送检。临床常用的呼吸道样本包括痰液、肺泡灌洗液、血液、胸腔积液等，其各有优缺点，应根据实际情况取材。痰液标本取材简单，但存在口咽菌群污染的可能，对深部肺部感染的代表性差，容易出现假阳性，特异性不及肺泡灌洗液。肺泡灌洗液多用于诊断深部肺部感染，灵敏度和特异度均较高，且与痰液标本相比，肺泡灌洗液受定植菌的影响较小，但其为侵入性检测手段。血液标本采集方便，临床上常用于脓毒血症、菌血症患者，但当局部感染发生在富含血液的组织(如肺)或为侵袭性感染(如侵袭性真菌病)时，病原体或其分解片段很有可能进入循环系统。血液标本避免了呼吸道定植菌的干扰，且较支气管镜的侵入性小，对于无法配合支气管镜检查的患者，也可以考虑血液标本检测[33]。另外，血浆游离DNA在感染性疾病的诊断以及疗效评估等方面也具有潜在价值[34]。Langelier等[35]指出，虽然血浆标本代表性不及呼吸道标本，但在无法获得呼吸道样本的情况下，血浆mNGS也可能对肺部感染患者的病原体有诊断价值。胸腔积液适用于肺部感染合并胸腔积液形成的患者，标本污染概率相对较小，但其适用范围小。因此，对于临床需要mNGS帮助明确病原体以及对支气管镜检查无明显禁忌的患者，可选择肺泡灌洗液-mNGS检测，对于无法配合支气管镜检查的患者，也可选血液标本或痰液标本，但这两种标本mNGS结果的解释，应综合多重因素慎重考虑。

3.3标本的处理 在标本的采集及处理过程中，首先要严格控制污染，其次是标本的预处理。预处理能有效去除宿主核酸或富集病原体核酸，提高检测阳性率。临床采集的标本经滤过及离心后，病原体的阳性率有所提高，但大分子病原体的阳性率可能会降低；用核酸酶降低人类背景核酸量，也能使病原体序列数相对增加[36]。同时，Hasan等[26]研究指出，与单用核酸酶相比，使用核酸酶前用皂苷进行预处理可使更多的人类DNA被降解，且对病原体核酸的影响较小，能有效提高检测的灵敏度和结果判读的精准性。除使用核酸酶外，也可基于成簇的规律间隔的短回文重复序列去除不需要的高丰度宿主序列[37]。对于低滴度病毒(尤其RNA病毒)感染，还可通过病毒纯化、病毒基因组扩增或捕获探针富集等方法增加病原体核酸量，但其价格昂贵且过程复杂，不适用于所有样本的处理。Deng等[38]开发了一种相对简单、成本低且快速的检测方法，即宏基因组加标引物扩增技术，该技术靶向富集RNA病毒序列，同时保留了其他病原检测的敏感性，且较聚合酶链反应及捕获探针富集技术的偏向性及交叉污染的发生率低，但宏基因加标引物扩增技术在DNA病毒及其他病原体中的应用仍待进一步研究。在mNGS处理过程中需进行系统工作流程评估及质量控制，Bal等[39]在mNGS中引入了3个质量控制流程，即无模板对照、内部质量控制和外部质量控制，其中无模板对照用于评估过程中存在的污染问题，内部质量控制及外部质量控制用来检测试剂、设备的完整性以及抑制剂的存在，这种优化的流程可增加结果的可信度和代表性。

3.4数据分析 精准区分病原体、定植菌和污染是目前mNGS数据分析较为棘手的问题。即便是目前最优化的mNGS操作流程，也难以实现理想的无污染。Davis等[40]提出了一种直接判断mNGS中污染的方法，即当微生物测序数量与样品总输入量成反比时，提示可能存在污染；Zinter等[41]在此基础上进行了优化，通过评估每个样本的学生化残差，对样本中存在污染物的程度进行一个量化的概率评估，帮助将污染与真实样本成分区分开。Langelier等[25,42]研究表明，在免疫抑制患者中，宿主的免疫反应指标被视为活动性感染的标志物，肺部微生物群改变也能在一定程度上反映肺部感染，结合病原体、呼吸道微生物组和宿主免疫基因表达指标综合分析，使临床确诊感染但传统检测为阴性的患者获得更准确的病原学诊断；同时他们还开发了一种互补算法，能够帮助区分致病病原体及背景微生物群。临床实践中，需要将mNGS结果与临床表现、其他实验室检查结果以及医师的经验结合起来共同判断，才能更有针对性地找出真正的病原体。

4 小 结

mNGS具有快速鉴定、无偏倚、灵敏度高的特点，在不同类型肺部感染的病原学诊断、指导治疗、疾病的预防控制、耐药基因的发现等方面均具有重要作用，是临床病原学检查的优选方法之一。虽然mNGS前景可观，但在临床实际应用中仍存在一些问题。如何进一步提高mNGS的特异性、优化标本的处理流程，以保证各种病原体的检测质量以及制订统一的结果判读标准等仍有待更深入的研究。因此，未来应开展相关实践研究，充分发挥mNGS的优势，同时改善其不足，使mNGS在肺部感染中的临床应用价值最大化。