骨科生物材料的高通量设计研究*

纪雄发 邵宏伟 张余

（广东省医学科学院广东省人民医院骨科，广州 510000）

2020 年骨科植入材料的全球市值约为490.2 亿美元，并以5.1%的增长率快速升高[1]。长期以来，中国在临床实践过程中所使用的假体等植入物主要由强生、捷迈邦美、史赛克等欧美公司提供。伴随我国科技实力的增强和外资的进入，国内企业的技术、工艺、研发和管理水平都得到大幅提升，截至2019年国内企业所占市场份额达到40%，销售额增至60 亿美元[2]。目前，临床应用的骨科植入体以惰性金属材料为主，其加工方式主要为传统的模具成型和机床加工。在“健康中国2030”规划纲要和“中国制造2025蓝皮书（2018）”的战略背景下，国内在此领域取得了长足进步，但与欧美发达国家之间仍存在差距[3]。传统的骨科生物材料存在许多缺点，如生物活性不足、骨整合性能差及术后翻修率高等问题，对患者的康复和生活质量产生了严重困扰[4]。我国极为重视骨科生物材料的基础研究并投入大量研究资源，适合临床应用的新一代骨科生物材料成为研发热点，有望实现弯道超车。

骨科生物材料需要在体内应用，因此研究存在诸多挑战：①材料成分和结构与机体之间复杂的相互作用；②针对筛选出的关键作用进行材料设计；③新材料的生物验证。经典的研究思路主要是通过研究者的经验对生物材料进行设计制造，再通过细胞和动物等模型进行功能验证[5]。这种研究方案效率低下，研发周期长，失败风险高且存在临床应用的伦理问题，极大限制了生物材料的临床转化进程[6]。材料的高通量设计研究是指通过材料计算科学大规模生成并制备出具有不同性质与结构的生物材料，使用实验室手段研究其对细胞行为的影响，从而筛选出关键的材料因素。高通量设计研究作为材料研究的热门研究方法，在骨科生物材料的设计和应用领域也有极高的应用潜力。本文就近年来骨科生物材料高通量设计研究的关键因素、制备技术及应用现状进行综述，并展望其发展前景。

1 骨科生物材料高通量设计研究的关键因素

生物材料与体内细胞的相互作用是个复杂的过程，涉及众多的信号通路[7]，目前进行深入研究的难度较大。通过近几十年来的材料生物学研究，总结出影响细胞行为的关键因素是生物材料的成分、结构（纳米尺度、微米尺度、大体尺度）、表面功能化方法等，通过对这些因素的高通量设计研究，有望获得最优的骨科生物材料。

1.1 生物材料成分

生物材料的成分和配比对干细胞的黏附、增殖和分化产生重要影响[8-10]。Khan 等[11]用市面上购买的廉价且特性良好的生物可降解聚合物，通过高通量设计研究的材料配方与微阵列技术相结合，分析135种二元聚合混合物对骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）的生长和分化等生物功能的作用。通过实验确定混合物具有良好的细胞黏附性，某些特定组合的混合物显示出明显的类骨结构，可为BMSCs 的生长和成骨分化提供三维仿生支架从而促进骨再生的进程。Dolatshahi-Pirouz 等[12]通过高通量设计研究得出适用于骨组织修复的材料配方，同时利用三维细胞装载的凝胶微阵列用于筛选不同的基质成分，以快速且高性价比的方式筛选不同条件，可以广泛应用于组织工程。细胞和蛋白质阵列在生物反应的高通量设计研究中表现出显著的效用，但是缺乏活体组织和器官本身的复杂性。Beachley等[13]将组织细胞外基质（extracellular matrix,ECM）颗粒作为二维阵列与细胞相结合，生成三维细胞-基质微组织阵列。通过对ECM 进行高通量设计研究，将组织的特定成分与生物活性相联系，为生物材料的研究设计、深入了解再生和疾病机制提供新途径[13]。

1.2 生物材料结构

材料的表面形貌性质对细胞的分化有显著的调控作用[14,15]。在无成骨诱导剂的情况下，依赖材料表面微纳结构的改变重新编程细胞分化方向，被认为是下一代骨科植入物设计的新方向[16]。Faia-Torres等[17]在临床相关的生物可降解聚合物材料聚己内酯（polycaprolactone,PCL）的表面设计了从亚微米到微米范围（0.5～4.7 μm）的表面粗糙度梯度（Ra），以及平均峰间距离（RSm）从214 μm逐渐变化到33 μm。在一系列高通量设计研究的结构组合中，研究其对BMSCs在缺乏地塞米松（desamethasone,Dex）的成骨诱导培养基（osteogenic induction medium,OIM）和基础生长培养基（basal growth medium,BGM）中碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、Ⅰ型胶原蛋白（collagen type I,COLⅠ）的表达以及矿化能力的影响。与对照组相比，在OIM 中Ra:1.53 μm/RSm:79 μm 和BGM 中Ra:0.93 μm/RSm:135 μm 分别显示出更佳的促成骨性能。对线性变化Ra 的高通量设计研究显示，仅0.93 μm的平均PCL粗糙度就可以作为可溶性成骨诱导剂的有效替代物。这一策略可为材料表面的设计提供指导，以增强材料的成骨性能。表面图案化在引导细胞行为方面也发挥着重要作用，但目前直接在金属植入物上设计高分辨率的微图案仍是巨大挑战，且缺乏能够将体外筛选的转化作为体内组织反应的证据。Zhu等[18]利用光刻技术和电感耦合等离子体（inductively coupled plasma,ICP）的干法蚀刻技术，在钛合金基底上精确制造形状和尺寸可控的微图案，构建出包含34 个具有不同几何参数微槽图案的钛合金用于对成骨细胞接触引导的体外高通量设计研究，在体外系统研究了表面图案尺寸、细胞形态特征、增殖和成骨标志物表达之间的相关性。研究结果显示，微槽图案参数对成骨细胞的增殖几乎无影响，但对细胞的形态、方向、焦点黏附（focal adhesion,FA）的形成和体外的成骨分化有明显的调节。而脊宽3 μm、槽宽7 μm、深度2 μm 的特定凹槽图案可以通过调节FA 的分布有效排列细胞，形成各向异性的肌动蛋白细胞骨架，从而促进成骨分化。该研究提出的微加工方法可扩展到钛合金上制造各种形状和尺寸控制的微图案，而且还为骨科植入物的表面结构设计提供了启示。

1.3 表面功能化方法

植入物表面特性的差异间接调节了影响细胞命运的大量信号通路，基质化学和微观结构的变化也被证明能够影响干细胞的生物学行为，但其深层机制尚不清楚[19]。Li 等[20]选择经过组织培养的聚苯乙烯（tissue culture-treated polystyrene，TCP）和左旋聚乳酸[poly(L-lactic acid),PLLA]基质进行BMSCs 的培养，这些基质具有不同的地形（Fl：扁平状、Fs：纤维状）和化学成分（Pr：原始、Am：胺化），随后对BMSCs进行RNA 测序分析。差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）分析显示，表面拓扑结构比表面化学成分能更明显改变基因表达。与TCP控制相比，Fl 和Fs 拓扑结构在基因表达方面表现出相反的表达谱。此外，化学处理的效果与拓扑结构的效果以协同的方式相互作用，Pr 样品比Am 样品促进更多的DEGs表达。该研究强调培养表面对整体基因表达谱的调节具有重要作用，而且还提供了细胞与材料相互作用的新见解。生物肽被广泛用于表面修饰，以开发适配性更好的植入物，其中包括细胞黏附精甘天冬氨酸肽和抗菌肽（antimicrobial peptide,AMP）。然而，如何筛选出预期活性的肽序列仍是巨大挑战。Fang等[21]开发了高通量的策略，以点击反应为平台制备具有肽密度梯度的表面，从而筛选出具有所需活性的位置。该策略为合理设计和制备功能性生物材料提供了可行策略。此外，阳极氧化是另一个简单、高通量和低成本的化学反应过程，产生的纳米多孔氧化物涂层可以促进骨结合并赋予抗菌和免疫调节特性[22]。上述这些表面改性方式可为优化植入物表面性质提供高通量的筛选手段，加速骨科生物材料的转化进程。

2 骨科生物材料高通量设计研究的制备技术

高通量材料筛选基于高通量设计研究和数据库建立，其中计算材料设计是材料科学的一个新兴领域[23]。通过将材料的基础理论与智能数据挖掘和数据库建设相结合，并利用当前超级计算机架构的力量，可快速产生、管理和分析巨大的材料数据库，为研究材料和细胞的相互作用以及发现新型材料奠定理论基础[24,25]。同时通过拓扑结构优化，可基于计算机高通量筛选的方式获得力学适配的植入体结构，避免出现应力遮挡造成的并发症[26]。在材料临床数据库领域，张余团队通过收集肿瘤患者不同类型植入体（如羟基磷灰石类、金属类、有机高分子类等）的临床数据，统计植入后肿瘤的复发率，建立植入物-肿瘤复发数据库，可为骨肿瘤相关生物材料的高通量设计研究提供参考。另一方面，实现生物材料高通量设计研究的关键在于高通量筛选。传统经验式的制备方法效率低、稳定性差，无法满足大规模的异质性材料制备。随着新技术的出现，该难题正逐渐被攻克。目前最有应用前景的实现方式主要包括微阵列、3D打印和微流控等技术。

2.1 微阵列技术

新型生物材料的高通量设计研究可通过组合方法筛选不同材料来实现，以确定满足特定生物医学应用的最佳成分。Hook 等[27]研究发现，对于聚合物组合的研究来说，微阵列是一种适合的实现形式，可满足在单一平台上监测成千上万细胞与材料的相互作用。聚合物微阵列可以通过将单体打印到芯片后进行聚合制备。材料的表面特性可以通过飞行时间二次离子质谱法（time-of-flight secondary ion mass spectrometer,ToF-SIMS）、X 射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy,XPS）和水接触角（water contact angle,WCA）测量等方法进行分析并与生物性能相关联，在分析表面特性的基础上，也可为材料设计提供相关的基础。基于聚合物微阵列的高通量材料可应用于从异质性细胞群体中分离特定的细胞，研究干细胞的附着和分化以及细胞的可控转染。高通量聚合技术的进一步发展可基于聚合物微阵列的组合空间探索生物现象并提高效率，这可为发现更多优化的聚合物材料奠定基础。

2.2 3D打印技术

基于3D打印技术的多孔支架开发在骨组织工程领域受到极大关注[28-30]。然而，现有生物材料常不能满足临床对结构支持、骨诱导性和可控生物降解性的要求。3D打印与传统的材料加工方法截然不同，其作为一种自下而上的制备技术，可控微结构可在复杂组合中满足骨缺损的需求[31]。宏观层面上材料的最优组成和配比以及微观层面上疾病的状态和植入物的相互作用均是3D 打印骨科植入体需要考虑的因素[31]。3D打印技术个性化制备的特点，使得研究者能够高通量筛选出有利于骨缺损修复的材料组成和结构，为骨科植入物材料研究体系提供海量的实验数据[30]。

2.3 微流控技术

微流控作为另外一种高通量设计研究的手段正在成为研究的热点技术，而能够模拟骨骼结构和功能的微流控芯片将为骨骼相关生物医学研究提供重要平台[32]。羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）是一种生物活性陶瓷材料，具有与骨矿化产物相似的结构和组成。Tang 等[33]使用HA 作为微流控芯片组件，以提供一个高度仿生的骨环境，采用陶瓷立体光刻（stereolithography apparatus,SLA）技术打印了具有不同微通道结构的HA 基底，最小沟槽宽度为50 μm。带有微通道的HA 基底被一层薄的聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane,PDMS）密封，制成了HA-PDMS微流控芯片。细胞培养实验表明，与单纯PDMS 组相比，HA组更有利于成骨分化。此外，模型药物盐酸多柔比星（doxorubicin,DOX）的浓度梯度在圣诞树结构的HA-PDMS芯片上成功生成，并测定了DOX的半数最大抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）。该研究结果表明，HA-PDMS 微流控芯片在骨科药物的高通量筛选和骨科相关研究领域具有巨大潜力。Lee 等[34]使用微流控三维骨组织模型，对骨科植入物相关生物材料的功效进行高通量的评估，同时研究植入物细菌感染的相关问题，将含有抗生素和双相磷酸钙（biphasic calcium phosphate,BCP）的纳米颗粒，分散在多聚物基质中，构建出一个由八个含有微图案的培养室组成的微流控体系，对其杀菌和促成骨效应进行评估。该研究显著减少了所需的生物材料样品和培养实验的数量，以及可在原位监测生物材料与骨细胞的动态相互作用，加快骨科植入材料的研发进程。

3 骨科生物材料高通量设计研究的应用现状和展望

在通过高通量设计研究筛选出最优的骨科植入材料并进行临床应用方面，3D 打印技术走在前列[35]。临床医师将患者数据传输至专业3D 打印公司，分析软件基于骨缺损的特点通过高通量的筛选获得最优的形状和结构，最后通过3D 打印将植入体打印为个性化产品，应用于人体修复缺损部位[36]。基于患者的个性化3D 打印技术是骨科医师需要把握的发展方向[37]，但是基于3D 打印技术的骨再生策略在骨科领域仍未得到充分验证，可能是由于缺乏对指导和促进骨形成的生物机制的了解[38]。用于骨再生的设计系统（即固定系统和支架）仍处于概念状态，进展缓慢。通过高通量设计研究进行更高效率的研究，获得更多的实验数据以丰富骨科生物材料设计的理论体系，在未来几年将明显加速该领域的进展，将开发出安全、强大和标准化的临床解决方案[39]。

4 小结

骨科生物材料的高通量设计研究作为一种新兴的材料研究手段，可大规模研究材料性质对自体修复的作用，筛选出具有临床应用价值的材料因素，对骨科植入体进行进一步优化，有望极大促进骨科生物材料临床转化的进展。