牙体组织粘接界面观察分析方法的研究进展

马超群， 刘猛， 仇珺， 廖紫璇， 周唯， 陈吉华

1. 口腔疾病国家临床医学研究中心 军事口腔医学国家重点实验室 陕西省口腔医学重点实验室 第四军医大学口腔医院修复科，陕西 西安（710032）； 2. 口腔疾病国家临床医学研究中心 军事口腔医学国家重点实验室 陕西省口腔医学重点实验室 第四军医大学口腔医院牙体牙髓病科，陕西 西安（710032）

随着口腔粘接修复技术的发展，牙科粘接技术与材料已被广泛应用于牙科治疗的各个领域。粘接效果的评价包括临床观察和实验室检测两部分，实验室检测中对粘接修复材料与牙体硬组织结合界面的观察分析是评价粘接效果的重要手段。根据研究目的不同，学者们开发出了多种用于粘接界面形貌性能观察分析的方法。牙体组织粘接界面的观察分析主要借助于各种显微镜。而在具体的检测中，显微镜的功能又不仅限于一般的形貌观察，还可以对物质的成分结构生物活性等进行检测，甚至有些显微镜成像原理即为物质成分差异。根据对相关文献的收集与整理，将目前最常用的粘接界面观察分析的方法按照显微镜类型进行了分类叙述，其中也包括基于显微镜观察的其他分析方法，如下。

1 扫描电子显微镜（scanning electron micrographs，SEM）

SEM 是一种通过收集电子束与试样表面作用产生的信号生成图像以达到对试样表面形貌呈现的方法。电子束可使试样5～10 nm 厚度的表层电离逸出大量二次电子。试样某部位二次电子的产额与试样表面的凹凸形貌以及成像的亮度正相关［1］。所以普通模式下的SEM 图像特点为凸出的地方亮度高而凹陷的地方亮度低［2］。入射电子也有一部分会被试样50～100 nm 厚度的表层反射成背散射电子。试样某部位背散射电子的产额与该部位元素的原子序数高度成正相关。所以背散射模式下的SEM 图像特点为元素原子序数高的区域亮度高，而原子序数低的区域亮度低［3］。这种模式适用于粘接界面纳米渗漏的观察，因为可以显示银离子的位置［4⁃5］。然而背散射模式下的SEM 成像分辨率要低于普通模式。

SEM 观察样本的制作分为两步。第一，粘接试件制作，按照需求制备相应的粘接样本，并通过切割或其他方法形成适当的形态；第二，电镜样本制作，根据需求样本可经过或不经过固定、脱矿、脱胶原、超声清洗、表面抛光、梯度脱水等处理，最后进行喷金。SEM 观察深度较浅，其样本制作对表面处理要求较高，但样本表面经过切割会产生玷污层从而影响观察。对于切割产生观察面的样本就需要去除玷污层，可以采用高度抛光或表面酸蚀的方法，或者根据需要仅保留部分结构，如用磷酸盐及次氯酸去除全部牙体组织而仅保留树脂结构［6⁃7］。抗酸碱层则可能需要更为负责的样本表面处理方法［8］。

SEM 界面形态景深、视野大，立体效果好，能够比较清晰地反映牙本质胶原纤维和树脂的位置关系。此外还可利用SEM 相配套的X 线能谱仪（X⁃ray energy dispersive analysis，EDS）对界面结构的元素组成进行深入分析；但表面处理可能难以保证界面结构完全不受损伤。此外，在真空干燥环境中观察会引发材料及组织收缩，产生裂缝影响观察效果。针对干燥的问题也可用环境扫描电镜（environmental scanning electron microscope，ESEM）进行观察，但ESEM 分辨率不及SEM，使用仍具有一定局限性［9］。

2 透射电子显微镜（transmission electron micro⁃scope，TEM）

TEM 是一种通过收集电子束透过试样后的电子信息，生成图像以达到试样微观结构与成分分析的方法。TEM 观察试样通常为80～100 nm 的超薄切片［10］。TEM 较SEM 有更高分辨率，可观察到试样内部的超微结构，在粘接界面观察中常应用于牙本质和混合层中胶原和矿物质或粘接树脂之间的结构关系和界面纳米渗漏的分析。

TEM 观察样本粘接制样较SEM 复杂，需进行脱矿处理，并经过多重固定，梯度脱水，包埋，染色和超薄切片等步骤。TEM 观察深入物质内部，可显示界面的超微结构，将树脂、胶原、矿物质的二维结构关系显示较为清晰［9］。但与SEM 相比，TEM无法反映界面的立体结构，且由于是超薄切片，样本制作的精细程度会对观察效果产生明显影响。

3 激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning mi⁃croscopy，CLSM）

CLSM 是一种在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图象处理，使用紫外或可见光激发荧光探针得到物质内部微细结构的方法。其所得图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点［11］。

存在于粘接界面的能被探测到的荧光信号分为两类。一类是外源性荧光，即荧光染料及荧光反应所形成的荧光信号；另一类是内源性荧光，即自发荧光。外源性荧光根据观察目的不同有多种形式：①染料标记界面结构，即在粘接制样过程中将荧光染料与粘接材料混合形成荧光标记的粘接材料，观察时荧光可显示粘接剂的位置，通过荧光信号反映粘接界面的形貌［12］；②染料渗透，即将粘接样本浸入荧光染料溶液中，染料会进入封闭性差的界面渗漏位置，实现对界面完整性的评估［13］；③荧光反应，当发生特异性反应时，原本淬灭状态的荧光剂被激活来探测目标物质在粘接界面的分布情况。如粘接界面原位酶谱检测，即将淬灭状态的荧光标记明胶溶液滴加在粘接试件上进行孵育，明胶酶活性增强时淬灭状态的荧光标记明胶被水解产生荧光信号，从而对粘接界面胶原破坏情况进行研究［14］。此外，还可利用死/活菌荧光染色试剂，对粘接界面内及下方牙体组织中细菌进行染色，观察致龋菌对粘接界面的破坏情况［15］。

内源性荧光则是粘接界面各物质结构在CLSM 激发光源的照射下所产生的荧光信号。据相关研究，健康及脱矿牙本质、粘接剂、复合树脂、粘接剂混合层等都能发出不同强度的自发荧光信号，从而用于对界面不同结构的区分，可对粘接界面的破坏程度、早期龋等进行观测［16⁃17］。

CLSM 样本制备简便，水不影响CLSM 扫描，可对正常湿度的试样观察，能保持样本的原始状态。CLSM 还可对样本表面下一定深度的地方进行扫描，通过计算机重建获得三维图像。但外源性荧光可能会因为制样过程产生一定的误差，如染料的外溢或混合不均匀。内源性荧光能够在一定程度上避免外源性染色所产生的误差，但是作为一种新的观察方法还有待研究。

4 拉曼光谱（raman spectroscopy，RS）

RS 作为一种分子振动谱线，其观察原理为拉曼散射和拉曼位移。不同化学键或基团特有的分子振动能产生特异性拉曼位移。在拉曼光谱的结果图中，X 轴代表拉曼位移，对应化学基团；Y 轴代表峰强度，和基团浓度呈正比。不同材料有特征性的拉曼光谱，可用于定性反映物质的组分和结构信息［18］。

常规粘接界面观察样本因切割会产生玷污层而影响RS 的定性分析。此时可通过高度抛光或酸蚀剂去除玷污层以增加拉曼分析的准确性。清除表面玷污层后便可直接进行观察，无需干燥。当检测靠近交界处的牙本质，若观测到树脂成分特征峰和牙体组织特征峰同时出现，证明树脂已经渗入牙本质小管。此外，若以特征峰为峰强热度值，可显示不同结构成分在粘接界面的分布［19］。虽然RS 不是一种严格意义上的定量检测手段，但可通过与正常牙本质及树脂的谱图进行对比，分析粘接剂对牙本质表面改造程度［3］。

相比于SEM 和TEM，RS 可通过分析化学成分变化精确反映界面结构，并可实现对粘接界面的多点连续监测，获得较为准确的界面结构成分变化情况［20⁃21］。

5 光学相干层析成像（optical coherence tomogra⁃phy，OCT）

OCT 通过光源的低相干光干涉原理和图像处理技术的融合，分析组织对光源产生的背向散射光和另一束光源产生的干涉光得到样品在不同深度的结构信息［22］。

在牙科领域，OCT 被首先用于对龋坏组织的观察，龋坏脱矿部位的信号强度灰度较周围正常牙本质高［23］。近年来，OCT 对粘接界面的观察主要集中于对界面微渗漏的分析。用于填充缺陷的介质和材料主体之间的光学对比度，会导致反向散射信号的可检测变化。作为缺陷区域，微渗漏的光学散射强度与其他部分有明显差异，在OCT 图像中，界面微渗漏表现为明显的灰度增强区域。此外界面或其他位置出现如气泡等较大缺陷，OCT图像中则表现为灰度减小的信号中断区域［24］。

OCT 成像具有非接触性、无损伤性、成像速度快等优点，观测不受水分影响。由于不需要切割，样本可反复使用，从而最大限度消除粘接耐久性检测中由样本误差带来的干扰。但由于组织自身导致的光学衰减，大多数组织中的OCT 成像深度在2～3 mm。OCT 的分辨率较低，难以对粘接界面的细微结构进行观察。

6 原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）

AFM 通过探针与物体表面结构发生力学作用，重现物体表面细微结构。其纳米级探针和微米级悬臂是成像的关键［25］，在测量时须注意对样本表面机械性能进行预估以选择适合的探针，对机械性能差异较大的不同结构进行连续检测时，也须及时更换探针以获得准确的测量结果，同时也避免仪器的损伤。其工作模式有接触、非接触和轻敲模式，牙本质粘接界面的结构分析常用轻敲模式。样品制作时仅需按照说明进行。观测面必须平整，因为AFM 只能处理表面一定高度变化，否则会产生低质量图像甚至损坏探针。尽量保证抛光等制备技术的质量，从而可获取最大分辨率［26］。

AFM 的轻敲模式可清晰地观测到树脂层、混合层、牙本质层、牙本质小管以及树脂突等结构［27］。除观测形貌外，AFM 还可通过对表面形貌进行三维分析，实现对牙本质小管直径、深度以及表面粗糙度的测量［28］。这种直接测量得到的表面粗糙度可用于酸对牙釉质的侵蚀程度和粘接剂附着力的分析［26，29］。此外，AFM 与纳米硬度计联合使用可用于样本表面纳米机械性能的检测，表面不同部位的力学性能差异以热度值表示，分辨率可达纳米级［30］。AFM 在牙齿硬组织表面结构形貌及性能分析中具有广泛应用。在粘接界面观测上，可尽量保存牙齿原貌，排除人为因素干扰，也不会受到样品表面水膜和残留的黏性粘接剂的影响，其多种模式也可适应不同环境。

7 小 结

以上6 种为目前评估粘接界面质量的最常用方法。SEM 在界面形貌观察中最为常用；对于超微结构的观察，如牙本质胶原、牙釉质釉柱晶体的观察，则必须使用SEM 或TEM 这种高分辨率的显微镜；CLSM 常借助外源性染色对粘接材料在牙体组织中的分布及形态进行观察；纳米渗漏检测中SEM 与TEM 均使用较多；微渗漏可用CLSM 荧光染料渗透法进行检测；OCT 在微渗漏检测中也有着良好的应用前景；对于界面结构成分的分析，可通过SEM 中的EDS 进行元素检测，也可使用RS 对特征化学键和基团进行分析；粘接界面的物理特性，如机械性能、表面粗糙度则可通过AFM 及相应设备进行检测。

【Author contributions】Ma CQ，Liu M wrote the article. Qiu J，Li⁃ao ZX collected the data. Zhou W，Chen JH revised the article. All au⁃thors read and approved the final manuscript as submitted.