上皮细胞-间质细胞转分化在慢性阻塞性肺疾病气道重塑中的作用

邹义敏

浙江省呼吸疾病诊治及研究重点实验室 浙江大学医学院附属第二医院呼吸与危重症医学科,杭州 310009

COPD 的特点为持续性气流受限,其主要病理基础是气道重塑和肺实质毁损。气道重塑的本质是细胞外基质合成与降解失衡所导致的组织纤维化形成,其主要效应细胞是成纤维细胞[1]。成纤维细胞来源可能有3个途径：组织局部成纤维细胞增殖、血液循环纤维细胞的募集、上皮细胞-间质细胞转分化 （epithelial-mesenchymal transition,EMT）途径[2]。EMT 这一现象最早是在观察鸡胚胎发育过程中发现的,由Hay[3]于20世纪70年代后期正式提出。EMT 不仅在胚胎发育,而且在恶性肿瘤转移、损伤修复、器官纤维化中起重要的作用。EMT 是否参与了COPD 发病以及其具体作用机制如何,本文就此作一综述。

1 气道上皮与COPD

气道上皮组织表面由纤毛细胞、杯状细胞、Clara细胞和基底细胞组成；纤毛细胞从气管到远端呼吸性细支气管均可见,随着气道直径的减小,纤毛细胞的高度由假复层柱状细胞向单层柱状细胞递减,这些气道上皮细胞通过细胞间上皮紧密连接形成有效的物理屏障,抵御病原体和有害物质的侵袭[4]。重要的是,气道上皮也是启动肺部先天免疫反应的第一道防线[5]。

烟草烟雾等有害物质长期暴露可损伤气道上皮组织导致COPD 发生。COPD 病理改变包括肺气肿、慢性支气管炎和肺血管改变[6]。大气道病变可见纤毛倒伏、上皮鳞状化生、黏液腺肥大、网状基底膜破裂、黏膜下基质增多、气道平滑肌增生肥厚等。黏液分泌过多和黏液细胞增生是大气道病变的特征,而炎症和纤维化是小气道病变最重要的病理改变。COPD 的气流受限是由外周而非中央气道管腔大小决定的,正常人肺内小气道 （直径＜2 mm）气流阻力微乎其微,但对于COPD 患者来说小气道却是气流阻塞的最主要部位。反复的气道损伤-修复循环导致气道重塑,这种病变早于肺气肿形成[7]；相对于肺气肿而言,小气道重塑是COPD 气流受限的主要原因[8]。气道重塑纤维沉积过多的主要效应细胞是成纤维细胞,其来源仍未完全知晓。

2 EMT

2.1 EMT 的概念 上皮细胞在各种诱发因素作用下,经过多方面生化改变,失去与基底膜连接的细胞极性等上皮表型,而获得较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型,这一生物过程称为EMT。即细胞从具有紧密连接、立方形、极性和缺乏动力的上皮细胞表型,转化为细胞间作用松散、梭形的、无极性、活动力强和能产生细胞外基质的间质细胞表型。EMT 在胚胎发育、肿瘤转移、损伤修复、器官纤维化中起重要作用[9]。

最新研究指出,体内EMT 的显著特征从上皮状态到间充质状态的转变通常是不完全的,导致细胞停留在同时保留上皮和间充质特征的中间状态。重要的是,这些不同的中间状态具体取决于所在的生物学环境[10]。因此,EMT并不是全或无的二元过程,而应该是一个连续性的动态过程[11]。

2.2 EMT 分型

2.2.1 EMT 亚型1 该类型发生在胚胎发育形成的正常生理过程中。中胚层原始间充质细胞通过EMT 的方式形成,随后,中胚层的间充质细胞通过 “间充质细胞-上皮细胞转分化”的方式,产生次级上皮细胞,最后形成中胚层和内胚层结构中分化发育成熟的上皮细胞。此类型只完成胚胎器官发育,而不会形成纤维化。

2.2.2 EMT 亚型2 该类型发生在成熟组织细胞被持续炎症等刺激因素所导致的损伤修复过程中,由上皮细胞或内皮细胞直接转分化为成纤维细胞,最终结果是导致纤维化。

2.2.3 EMT 亚型3 该类型发生在上皮来源肿瘤细胞转移过程中。在原肿块处第一步由上皮性肿瘤细胞转分化为转移性瘤细胞,接着迁移到远处形成继发性肿瘤结节。此类型不是导致纤维化,而是转分化成转移性瘤细胞,导致肿瘤侵袭和转移[11]。

2.3 EMT 生物标志物 EMT 的发生过程除了形态学改变明显之外,也会发生较多生化改变。上皮组织具有明显的极性,细胞间结合紧密,其连接方式有紧密连接、桥粒连接和缝隙连接,由闭锁蛋白、闭合蛋白、细胞角蛋白等构成,E-cadherin为其主要成分[12]。因此,使用的上皮细胞标志物主要有E-cadherin、细胞角蛋白等。间质细胞标志物常用的有波形蛋白、成纤维细胞特异性蛋白1（fibroblast-specific protein-1,FSP1）、α-平滑肌肌动蛋白等。波形蛋白是存在于大多数间质细胞内的中间丝,与微管及肌动蛋白一起组成细胞骨架。细胞外基质蛋白包括纤连蛋白、层黏连蛋白、I型胶原蛋白等,也可用作EMT 间质细胞标志物[13]。

3 EMT与COPD气道重塑

损伤后的肺稳态取决于肺组织上皮组织完整性的有效恢复,病理性损伤-修复循环导致纤维化在许多肺部疾病中被关注,包括肺间质纤维化、COPD、哮喘、囊性纤维化、肺移植闭塞性细支气管炎等[14]。目前认为,分泌细胞外基质的成纤维细胞池数量的增加可能有3种来源：组织局部成纤维细胞增殖、血液循环成纤维干细胞的募集、EMT 途径。EMT 在肺发育和肺癌中的作用被广泛接受,但是EMT 在气道纤维化疾病中的存在和作用不是很清楚,可能与缺乏对细胞环境可塑性和异质性的认识有关[15]。

较多体外实验研究结果证实气道上皮细胞具备发生EMT 的潜力。转化生长因子β （transforming growth factor-β,TGF-β）是一种有效的EMT 诱导剂,早在十年前,Kuroishi等[16]首先报道小鼠原代气道上皮细胞在TGF-β1 作用下可发生EMT,实验采用TGF-β1 刺激原代培养的小鼠气道上皮细胞,14 d后检测发现上皮细胞表型标志物表达明显减少,而α-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白等间质细胞表型标志物表达明显增多,并且免疫荧光染色提示上皮细胞标志物和间质细胞标志物共表达现象。Doerner等[17]接着在人支气管上皮细胞系和人原代上皮细胞也证实可诱导气道上皮细胞发生EMT。众所周知,吸烟和生物燃料烟雾暴露是COPD 重要的危险因素。最近有研究采用烟草烟雾提取物可诱导不吸烟者、吸烟者和COPD 患者的原代支气管上皮细胞发生EMT,其机制可能是通过活性氧自由基的产生从而促进TGF-β1的表达,同时降低环磷酸腺苷的水平[18]。通过人支气管上皮细胞系 （16HBE）,使用尼古丁、木材烟雾凝集物等刺激细胞72 h后,也观察到上皮细胞形态向成纤维细胞样改变,上皮细胞表型标志物与间质细胞表型标志物共表达,呈现EMT 特征性改变[19-20]。

目前,EMT 在COPD 气道重塑中作用的体内研究并不多。在大气道方面,Sohal等[21-22]通过支气管镜活检大气道上皮组织,进行EMT 标志物免疫组织化学染色,对比分析吸烟COPD 患者、既往吸烟COPD 患者、吸烟肺功能正常者、不吸烟肺功能正常者4组之间的网状基底膜破裂程度和EMT 标志物染色情况,结果显示COPD 患者和吸烟者的气道上皮基底层细胞处可见到FSP1 和波形蛋白双染阳性并伴有表皮生长因子受体表达增长的细胞；部分细胞出现细胞角蛋白与FSP1 共染色,这些强烈提示上皮细胞通过网状基底膜破裂处迁移进入上皮下固有层,分化为成纤维细胞样间质细胞,产生细胞外基质导致气道重塑,首次揭示体内EMT 参与COPD 患者的气道重塑的证据。与Sohal等[21]的研究选取大气道组织标本不同,有文献报道在吸烟COPD 患者小气道组织标本也观察到了EMT 参与气道重塑的依据[18,23]。Gohy等[24]通过手术切除肺组织标本,在小气道和大气道活检中均证实COPD 患者的传导气道管壁组织上都存在EMT 特征,并首次发现COPD 气道上皮EMT 改变与气道上皮下纤维沉积和气流受限呈正相关。大鼠被暴露于生物燃料烟雾7个月来制作生物燃料相关COPD 动物模型,通过免疫组织化学染色发现上皮下成纤维细胞数增加明显,并在小气道上皮组织发现ECadherin和FSP1共染色的细胞,证实EMT 参与了生物燃料烟雾暴露相关气道重塑的发生[20]。

尽管体内、体外研究均提供了一些证据提示EMT 与COPD 的气道重塑密切相关,但EMT 在体内应该是一个动态完整的过程,而目前的研究提供的仅仅是其中的部分片段,需要探索更好的能够动态观察的实验方法,来全程追踪EMT 在体内发生、进展的动态过程以及具体诱发机制。

4 EMT信号通路

各EMT 亚型无论是在胚胎发生期间还是在诸如癌症等发病机制中,能被多种生长因子、细胞因子、激素和细胞外某些因素所诱导和调节,包括TGF-β、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子等,其中,TGF-β作为一个强力、主要的诱发因子研究最多,越来越多的研究证实Smad经典通路和多条非Smad通路 （包括丝裂原活化蛋白激酶通路、Rho样GTP酶信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶通路）共同参与了TGF-β 诱导的EMT,引起三大转录因子家族（Snail家族、ZEB家族、b HLH 家族）表达改变,这些转录因子最后导致上皮标志性蛋白的基因表达受抑制,而间质细胞的基因表达被激活[25]。这些靶基因中一部分是Ecadherin、闭锁蛋白、紧密连接蛋白等的抑制因子,以及纤连蛋白、N 钙黏蛋白等的活化因子；还有一些作为EMT过程的信号分子,联系不同的信号通路,发挥重要的调节作用。此外,Shh信号通路、Wnt/β-catenin和Notch信号通路等也参与EMT 发生,这些通路之间似乎相互串联,并取决于受影响的特定上皮或内皮细胞类型,从而对EMT起一定的调节作用[26]。

5 EMT研究的临床意义

COPD 是一种发病率、致残率和病死率均高的慢性气道疾病,目前尚无有效延缓肺功能下降的治疗药物,迫切需要深入研究COPD 的发病机制,寻找新的治疗靶点。目前的大多数研究都集中在疾病终末期,而COPD 患者几乎一半以上的小气道在疾病早期阶段已被破坏,导致肺功能下降。EMT 在COPD 早期患者的大、小气道中都存在,与肺功能的下降显著相关,其发病可能通过最初的上皮细胞损伤激活而触发,要改变疾病轨迹,关键是要了解吸烟者早期损伤上皮细胞的机制,EMT 可能在COPD 气道重塑的发生、发展中发挥着重要作用[11,27]。虽然目前临床上还没有EMT 特异性的治疗药物,但新出现的证据表明,一些目前使用的药物可能会影响EMT 的过程。一项随机对照实验研究显示,与安慰剂相比,吸入丙酸氟替卡松6个月以上可抑制COPD 患者大气道中EMT 相关的部分改变,但似乎无法完全消除,这是第一次报道吸入激素在COPD中的抗EMT 作用研究[28]。矽肺动物模型研究发现,吡非尼酮可降低肺组织中TGF-β1和Smad2/3的表达,进而抑制EMT 过程和肺纤维化,其作用可能与TGF-β1/Smad信号通路有关[29]。Wang等[23]研究发现尿激酶型纤溶酶原激活剂受体在COPD 患者小气道上皮中的表达增加,使用Sh RNA 靶向沉默尿激酶型纤溶酶原激活剂受体可以抑制烟草烟雾诱导的人小气道上皮细胞的EMT 发生。尽管看到了新的希望,但是目前为止,能阻断COPD 气道上皮发生EMT 的治疗手段的相关研究报道还很少。

综上所述,气道上皮是呼吸道抵御外界刺激损伤的第一道防线,反复的损伤-修复循环导致气道重塑,而EMT可能是COPD 发病及进展的重要机制,已有初步研究表明拮抗EMT 信号通路可能有助于减轻COPD 气道重塑。今后需要进一步明确EMT 参与COPD 气道重塑的作用机制,寻找更有效的治疗靶点,来改善COPD 患者的肺功能和预后。

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