Dickkopf家族蛋白在非小细胞肺癌中的作用机制和治疗应用的研究进展

董程 综述 段勇 审校

肺癌仍然是世界范围内重要的公共卫生问题，其发病率和死亡率都位居恶性肿瘤的第1位，其中非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌的80%～85%[1-3]。在我国，由于汽车尾气、控烟不力、青少年吸烟人数剧增等诸多因素，我国肺癌发病率更是呈现有增无减的趋势[4]。

目前NSCLC的化疗方案通常由顺铂或卡铂双联体联合吉西他滨、长春瑞滨、紫杉醇、培美曲塞或多西他赛组成[5]。不幸的是，许多NSCLC患者表现出对化疗的耐药性。在过去的20年里，几种基于分子的靶向药物已用于NSCLC的治疗，包括突变、免疫检查点分子、与癌细胞增殖和存活有关的分子等[6]。最初反应良好，但是《ASCO年度报告：2018临床肿瘤学进展》指出[7]，有部分患者在接受免疫检查点抑制剂治疗时没有反应或疾病仍在进展。且随着免疫检查点抑制剂的广泛批准使用，其相关的并发症逐渐浮出水面。因此，有必要研究有效且新颖的治疗方法，特别是在肺癌相关信号通路领域。

既往研究已证实几种经典Wnt信号通路抑制剂对NSCLC具有抗癌作用，包括Dickkopf家族蛋白(DKKs)、分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)和Wnt抑制因子1(WIT-1)[8]。其中，DKKs参与多种人类肿瘤的发生发展和转移过程，特别是与NSCLC的关系，一直是人们关注的焦点。本文对DKKs在NSCLC中的作用机制和治疗潜力进行综述。

1 DKKs的概况

DKKs是一类含有255～350个氨基酸的分泌糖蛋白，是Wnt/β-catenin通路的重要调节因子[9]。DKKs家族有DKK-1、DKK-2、DKK-3、DKK-4及DKKL-1/SGY-1等成员。DKK-1、DKK-2和DKK-4的分子量为25～29 kDa，DKK-3的分子量为38 kDa，除SGY-1外，其他家族成员在结构上均含有一个N端信号肽和两个保守的富含半胱氨酸结构域(CRD)，即Cys1和Cys2，但这些成员间的氨基酸序列差异较大[10]。Cys1和Cys2被一个长度不同的连接区域隔开，这一连接区域在DKK-1、DKK-2和DKK-4之间较为接近，由51～56个氨基酸组成，在DKK-3中仅有13个氨基酸组成，故其他成员间的相似性要高于DKK-3。DKK-1、DKK-2和DKK-4之间的序列同源性为46%～50%，DKK-3和其他成员之间的序列同源性为37%～40%[11]。目前，对SGY-1相关的结构功能和相关的生物学作用知之甚少。

2 DKKs在NSCLC中的作用机制

2.1 DKK-1蛋白在NSCLC中的作用机制

DKK-1是经典Wnt信号转导最有特点的拮抗剂之一[12]。DKK-1在正常成人组织中的表达非常低，而在胚胎组织中的表达则很高[13]。据报道，与正常对照组相比，DKK-1通常在大部分肺癌细胞系中高度激活，并在肺癌组织和肺癌患者的血清中高表达[13-15，20]。重要的是，许多研究认为DKK-1与肺癌的分类、分期和肿瘤转移有相关[8]，并可能促进肺癌细胞的迁移、侵袭、增殖和上皮-间质转化(EMT)[16-19]，表明DKK-1可能是NSCLC进展中至关重要的致癌调节剂，并且在NSCLC免疫疗法中可能是不同于经典Wnt途径抑制剂的新型生物标志物和治疗靶标。进一步研究发现，DKK-1启动子甲基化于大多数NSCLC细胞系和组织中[8]。Na等[20]研究NSCLC早期病变发现，DKK-1启动子的甲基化与肺癌发病有关，在NSCLC中DKK-1功能被抑制，其表达下调。Xu等[21]研究发现，NSCLC患者血清DKK-1也是低表达。但是，Dong等[22]提出了不同看法，他们发现NSCLC患者血清中DKK-1过表达，且预示疾病的预后不良。这可能与DKK-1在NSCLC不同时期的表达量不同有关。Bhavanasi等[23]发现DKK-1与细胞骨架相关蛋白4(CKAP4)结合后，CKAP 4通过与PI3K的P85α亚基的SH3结构域相互作用，将磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)激活到细胞质结构域。通过这种机制，DKK-1激活AKT并促进细胞增殖。此外，DKK-1与CKAP 4的结合具有与辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP 5/6)相互作用无关的高亲和力。因此，DKK-1/CKAP4相互作用可能成为NSCLC的治疗靶标。

2.2 DKK-2蛋白在NSCLC中的作用机制

DKK-2作为Wnt信号通路拮抗剂，通过与LRP5和LRP6结合抑制Wnt/β-catenin信号传导。Shen等[24]发现DKK-2表达的上调存在于具有APC突变的人NSCLC和由APC缺失引起的小鼠肺肿瘤中，敲除DKK-2不改变LLC肺癌细胞的体外细胞增殖或凋亡，因此，DKK-2不直接影响肿瘤细胞本身的增殖和凋亡。然而实验报道在动物体内敲低DKK-2明显抑制肿瘤的进展，并推测DKK-2可能通过改变肿瘤微环境调节肿瘤细胞生长。同时使用DKK-2单克隆抗体5F8，观察到5F8抗体在原位肿瘤模型和基因工程小鼠肺癌模型中能够明显抑制体内肺癌细胞生长，再次佐证了这一推测。进一步用流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，发现抗DKK-2抗体处理的肿瘤样品中NK细胞数量显著增加。显然，DKK-2抗体可以直接增强对小鼠NK细胞的活化，活化的细胞毒性NK细胞在抑制肿瘤形成中具有重要作用，结果表明DKK-2抗体可用于APC突变NSCLC的靶向治疗。

2.3 DKK-3蛋白在NSCLC中的作用机制

DKK-3属于细胞外Wnt信号传导通路抑制剂，在包括肺癌在内的多种癌症中由于启动子甲基化而下调表达，低表达的DKK-3可能参与Wnt信号的激活，从而影响NSCLC的发生。同时，DKK-3能够抑制细胞增殖和促进血管形成，生物功能较为复杂。Yue等[25]对Wnt/β-catenin信号通路在肺癌中异常激活的机制进行了研究，发现在肺癌组织中DKK-3基因因启动子甲基化而失活，表明DKK-3在肺癌中呈表达抑制状态。同时雷艳荣等[26]采用实时定量PCR检测NSCLC患者肿瘤组织和癌旁组织DKK-3 mRNA表达，发现NSCLC肿瘤组织DKK-3 mRNA显著低于癌旁组织。据Li等[27]研究报道，DKK-3蛋白在高度血管化的肿瘤血管中表达，在体外对原代内皮细胞形成的集落细胞继续研究发现，用siRNA敲低DKK-3基因并不显著影响细胞增殖，但可以降低基质中血管的形成。这一发现给NSCLC的抗血管生成治疗带来了新的可能。另据报道，DKK-3的重新激活可能是由于β-catenin、MMP-7、Survivin、c-Myc和Cyclin D1等基因的表达降低所致，表明DKK-3能通过诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡，抑制细胞生长[8]。Song等[8]进一步研究发现miR-582-3p的过度表达可抑制Wnt通路的多个负调控因子，包括DKK-3、AXIN 2和SFRP 1，并过度刺激Wnt信号维持NSCLC的癌症干细胞样(Cancer stem cell like，CSC like)特性。因此，靶向miR-582-3p治疗可能是NSCLC治疗的新方法。

2.4 DKK-4蛋白在NSCLC中的作用机制

DKK-4是DKK家族蛋白中最小的成员，也是研究最少的成员。Sima等[28]发现DKK-1和DKK-4在各种Wnt信号通路上存在特征性的活性差异，DKK-4的作用仅限于某些Wnt信号通路，包括Wnt1、Wnt10a和Wnt10b，而不是既往所认知的规范Wnt3a信号通路，DKK-4对Wnt信号通路的选择性抑制作用提供了更多细微调节的可能性。另据报道，DKK-4由两个独立的折叠域(CRD1和CRD2)组成，折叠域之间由高度灵活的非结构化连接子连接。其中CRD2介导了LDL受体相关蛋白6的E1E2区域(LRP6 E1E2)和胞外结构域Kremen1蛋白(Krm1)的高亲和力结合。相反，CRD1仅与LRP6 E1E2具有中等亲和力，且不与Krm蛋白相互作用。还发现DKK-4和Krm家族蛋白协同作用，并形成包括DKK-4、Krm和LRP5/6蛋白在内的多种三元复合物，从而可以微调Wnt信号的传导[29]。

3 DKKs在NSCLC治疗方面的研究

3.1 DKKs在NSCLC化疗方面的研究

目前NSCLC的化疗面临巨大挑战，很多NSCLC患者表现出对化疗的耐药性，治疗失败仍然是一个关键问题。然而，有报道发现DKKs在NSCLC的化疗方面已经取得了研究进展，可能对NSCLC的化疗起到新的指导作用。

顺铂(DDP)是一种靶向DNA的细胞毒性药物，可抑制RNA转录，诱导细胞周期紊乱和细胞凋亡。顺铂在体内的耐药性很大程度上归因于DNA修复的增加，及促进凋亡-抗凋亡信号的失衡，这些信号由Wnt信号介导[30]。Cheng等[31]采用qRT-PCR检测30例晚期肺腺癌患者肺癌组织中DKK-1 mRNA的表达水平，发现与DDP不敏感NSCLC样品比较，DKK-1 mRNA在DDP敏感的NSCLC样品中表达水平较低(P<0.05)，表明DKK-1可能与顺铂耐药机制有关。Salim等[32]进一步研究发现DKK1可能是顺铂难治性NSCLC的标志物，并且是改善顺铂难治性NSCLC细胞对顺铂敏感性的潜在治疗靶标。另据报道，DKK-3通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，与顺铂协同作用，抑制NSCLC细胞的生长和迁移运动，并诱导细胞凋亡[30]。DKK-3对顺铂耐药的NSCLC具有良好的化疗增敏作用，是开发针对顺铂耐药NSCLC治疗和预防策略的理想靶点。

多西他赛(Docetaxel)是紫杉醇的半合成类似物，多西他赛通过抑制微管解聚，激活纺锤体装配检查点，随后引起细胞凋亡[33-34]。但是，在肿瘤晚期病灶扩散到肺部以外时，化疗药物变得越来越无效[35]。Tao等[36]发现，在多西他赛耐药的人肺癌细胞中，DNA甲基化诱导DKK-3下调，并通过上调MDR-1和P-gp的表达增强细胞耐药性。随后重新上调了DKK-3的表达，发现人NSCLC细胞增强了对多西他赛的化疗敏感性。表明DKK-3将来可能成为NSCLC患者逆转多西他赛耐药的潜在靶标。Yang等[37]将A549细胞以及多西他赛耐药的人肺腺癌(A549/DTX)细胞的培养上清液进行对比，发现DKK-4在A549/DTX细胞中的表达明显增加，并观察到DKK-4的敲低促进多西他赛抑制A549/DTX细胞的生长，增强多西他赛的促凋亡作用。这表明DKK-4在A549细胞对多西他赛耐药性中具有关键作用，并提供了多西他赛联合DKK-4治疗NSCLC的潜力。

3.2 DKKs在NSCLC靶向治疗方面的研究

在过去的20年中，基于分子的靶向药物已用于NSCLC的治疗[6]。然而，尽管现有的靶向疗法发展迅速，仍不能满足NSCLC治疗的需要。值得高兴的是，新的研究表明DKKs可能在NSCLC靶向治疗方面有所突破。

郭梦楠等[38]在四唑盐(MTT)比色法检测烟酸硒氰化合物SLL-1A-16对肺癌细胞A549、NCI-H460细胞增殖影响的实验中观察到，在两种肺癌细胞中化合物SLL-1A-16通过上调抑癌因子DKK-3，下调磷酸化信号转导及转录激活因子(p-STAT)蛋白表达，阻止mTOR信号通路的激活从而抑制NSCLC细胞增殖，诱导NSCLC细胞凋亡。结果表明，在未来化合物SLL-1A-16可作为一种靶向调节DKK-3表达的药物应用于NSCLC的治疗。此外，杨茜等[39]发现，左旋一叶萩碱可通过诱导SFRP-1基因和DKK-1基因的甲基化调节Wnt信号通路，最终抑制A549细胞的增殖。因此，左旋一叶萩碱拥有靶向调节DKK-1基因治疗NSCLC的潜力。

3.3 DKKs在NSCLC免疫治疗方面的研究

随着以PD-1单抗、PD-L1单抗和CTLA-4单抗为代表的免疫检查点抑制剂的使用，对NSCLC的治疗取得了明显的临床获益。但是，有部分患者在接受免疫检查点抑制剂治疗时没有反应或疾病仍在进展。既往研究对DKKs在肿瘤的免疫调节方面进行了探索。Maria等[40]发现，抑制DKK-3的表达可逆转CD8+T细胞的自身耐受性，增强实验小鼠对肿瘤的排斥反应。相反，促进DKK-3的表达可抑制CD8+T细胞上述反应。类似地，Suzawa等[41]的研究发现，DKK-3也在局部微环境中起作用，DKK-3通过抑制外周T细胞的活化和分化来控制NK细胞和CD8+T细胞的应答，不仅具有直接的抗肿瘤作用，还通过刺激免疫系统产生间接的抗肿瘤效应。研究结果表明，DKK-3是免疫反应的新型调节剂，并且DKK-3可能是用于控制肿瘤的免疫抑制靶标。Xiao等[42]发现，DKK-2通过与LRP5结合，抑制NK细胞和CD8+T细胞活化，促进肿瘤进展。进一步研究发现，DKK-2可以抑制PD-1单抗对肿瘤浸润免疫效应细胞的活化作用。因此，DKK-2可能是调节免疫检查点抑制剂治疗的潜在靶点。

4 小结与展望

DKKs包括DKK-1、DKK-2、DKK-3、DKK-4及DKKL-1/SGY-1等成员，与NSCLC细胞增殖、转移、侵袭密切相关。DKKs各成员在NSCLC中的表达和作用机制不同，某些作用机制有望为NSCLC的防治提供新的理论依据。但是，DKK-1在NSCLC中的表达和调控存在争议，DKK-4在NSCLC中的研究较少，说明DKKs在NSCLC中作用机制的复杂性及部分研究的不全面。治疗方面，DKKs可增强耐药NSCLC对化疗药物敏感性，证实DKKs在NSCLC靶向治疗和免疫治疗中的潜力。但是能否通过检测DKKs在不同个体中的表达，预测不同个体对化疗药的敏感性，实现最佳的个体化疗方案，还需继续探索。此外，在肿瘤靶向治疗和免疫治疗发挥巨大潜力的今天，还缺乏更大队列的实验性研究和临床观察支持DKKs在NSCLC靶向治疗和免疫治疗的临床应用。总之，对于DKKs在NSCLC中的研究还处于起步阶段，关于DKKs在NSCLC的作用机制还未完全明确，未来DKKs可能在NSCLC靶向治疗和免疫治疗中成为研究热点。