外泌体在胰腺癌诊疗应用中的研究进展

李宗倍,李华志,郭春海,崔宏力

李宗倍,李华志,郭春海,崔宏力,清华大学附属垂杨柳医院普外科 北京市 100022

0 引言

长期以来细胞间相互作用的主要方式为受体和配体的相互作用或直接的细胞间相互作用.1987年Johnstone等[1]在研究机体红细胞转变过程中，在细胞外发现了一种由网织红细胞分泌的脂质双层结构囊泡小体，其参与介导细胞间的广泛信息传递，将其命名为外泌体;外泌体可由源自机体多种不同类型细胞释放，遍布于血液、尿液、脑脊液、唾液等体液中;在肿瘤微环境中外泌体的含量尤为丰富，其内含有多种生物活性物质与肿瘤的发生发展、免疫逃逸、微环境建立等密切相关[2，3]，近年来由其介导的新的细胞间信息传递和物质交换途径越来越受到学者们的关注.

1 外泌体在胰腺癌发生发展中的作用机制

在生理条件下，外泌体作为细胞间信号传递的主要调节因子，起到促进细胞间信号传递的作用.在病理条件中，这种信号传递机制对于肿瘤细胞生长及远处转移有其特殊性.（1）胰腺癌微环境中包含大量间质组织，约占总体积的90%[4].大量的间质组织使胰腺癌细胞处于高度免疫抑制状态，利于胰腺癌细胞的免疫逃逸和远处转移[5].胰腺星状细胞（pancreatic stellate cells，PSCs）是一种重要的胰腺间质细胞，最初处于静息状态，当受到外界刺激后可转化为活化状态的肌成纤维细胞，而肌成纤维细胞可直接促进肿瘤细胞生长及刺激肿瘤血管生成[6];（2）肿瘤源性外泌体一方面可通过改变基质细胞靶点和表型，如正常的成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）转变，继而形成了有利于肿瘤生成的微环境[7];另一方面可通过调节细胞周期基因、黏附分子、趋化因子配体、血管形成等基因mRNA的表达，进而调节转移前微环境[8].此外肝脏库普弗细胞通过摄取来自胰腺癌的富含巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）的外泌体，进而激活纤维化途径，亦可形成支持胰腺癌转移的微环境[9];（3）肿瘤源性外泌体可破坏并重构血管内皮细胞，通过促使肿瘤细胞侵入血液循环或生成新生肿瘤血管，而达到远处转移[10];（4）外泌体参与机体内多种生理过程的调控和免疫监视，在胰腺癌的发生发展和侵袭转移过程中也发挥着不可或缺的作用[11];（5）Ostenfeld等[12]研究发现高转移潜能肿瘤源性外泌体富含肿瘤抑制的miRNA，肿瘤细胞通过舍弃外泌体内的抑癌基因，从而获得转移潜能.

2 胰腺癌的外泌体肿瘤标志物

CA-199作为胰腺癌的肿瘤标志物由来已久，然而其特异性与灵敏性均较低.外泌体内包含宿主细胞所特有的生物活性物质，可反映来源细胞的病理生理状况，且肿瘤源性外泌体所负载的信息物质和正常细胞源性外泌体间存在较大差异[13]，当肿瘤源性外泌体携带有宿主细胞的致癌特异性物质进入血液循环中，通过检测此类外泌体上的特异性肿瘤信号物质，有望成为诊断胰腺癌的特异血清学标志物.

2.1 外泌体来源蛋白 美国研究者Melo等[14]研究发现肿瘤源性外泌体表面特异性地聚集着一种蛋白多糖磷脂酰肌醇聚糖-1（glypican-1，GPCI），在胰腺癌患者的血液中也可检测到GPCI阳性的外泌体，且具有较高的特异性和敏感性，并借此可与健康人群和胰腺良性疾病患者进行区分[15].

2.2 外泌体来源基因 Zhang等[16]研究发现胰腺癌患者血液中的外泌体含有大量肿瘤遗传信息物质，涵盖了基因拷贝数扩增、基因突变和基因融合，经过富集提纯后，肿瘤源性外泌体中的突变基因如KRAS、TP53、CDKN2A、SMAD4的检测灵敏度高于血中游离肿瘤DNA的检测;PSCs释放的含有miR-21的外泌体，可通过促进胰腺癌上皮细胞向间质细胞转化，进而增强其增殖能力[17-19];Que等[20]在研究胰腺癌患者血清外泌体时发现miR-21和miR-17-5p基因的表达水平高于正常对照组;因此，通过检测胰腺癌患者血清中外泌体内的特异基因表达水平，有望成为检测胰腺癌的一种潜在的非侵袭性诊断和筛选方式.

此外，选择敏感的蛋白和miRNA标志物联合检测可提高胰腺癌早期诊断的特异性和灵敏度.研究表明，由5种蛋白质（CD44v6、Tspan8、EpCAM、MET和CD104）和4种miRNAs（miR-1246、miR4644、miR-3976和miR-430）的组合在区分胰腺癌患者、急慢性胰腺炎患者和胰腺良性肿瘤患者中的敏感性为1.00，特异性为0.80[21].

3 胰腺癌高危因素与外泌体的关系

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）主要起源于胰腺导管上皮，其病因复杂、早期诊断困难、手术切除率低，对化疗药物易产生耐药性，长期以来困扰着临床医生，因此探索病因、关注高危人群、收集少见病例、分析误诊原因等是提高胰腺癌早期诊断率的重要方式.在中华医学会胰腺外科学组发布的《中国胰腺癌诊治指南（2021）》中指出，与胰腺癌发生相关的危险因素主要有肥胖、2型糖尿病、吸烟、酗酒等，其中5-10%患者存在遗传易感性[22].

长期吸烟、酗酒等均可导致正常胰腺细胞产生不同程度的应激反应，研究表明[23]，当正常胰腺细胞受到内环境变化影响时，可通过释放外泌体对应激反应作出相应应答，且释放的外泌体组成、功能等与受应激因素有关，以此来调节细胞间信息传递.当胰腺细胞长期持续处于应激状态致基因突变时，外泌体即可将相应生物学信息传递给其他正常细胞，最终导致原癌基因的激活及细胞依赖性生长能力的丧失，从而促进肿瘤的发生.

葡萄糖作为细胞最重要的营养物质之一，其不足和过量均会引起细胞应激，并可通过释放外泌体对其产生应答.Ling等[24]发现高糖应激时肾小管上皮细胞释放的外泌体可促进其内α-平滑肌肌动蛋白的表达，从而抑制肾小球系膜细胞的增殖并促进上皮向间质的转化.长久以来，人们普遍认为糖尿病与胰腺癌存在紧密联系，部分学者认为其可能是胰腺癌发生的独立危险因素[25].是否糖代谢异常通过外泌体传递信息进而导致胰腺癌的发生，目前尚无关于此类的研究，笔者相信通过收集并研究分析胰腺癌合并糖尿病患者血液中的特异性外泌体及相关生物信号传递途径，有利于规避胰腺癌的发生.

4 外泌体在胰腺癌治疗中的应用

4.1 外泌体的免疫调节功能在胰腺癌治疗中的应用 目前越来越多的研究表明外泌体具有免疫调节功能.Zitvogel等[26]发现，由树突状细胞（dendritic cell，DC）分泌的携带有肿瘤特异抗原的外泌体作为肿瘤疫苗可使荷瘤小鼠的肿瘤消退.DC源性外泌体表面含有具有抗原提呈作用的主要组织相容性复合体（major histo-compatibility complex，MHC），使其具有相应的特异性，研究表明，DC源性外泌体诱导的抗肿瘤机制主要是通过刺激T细胞增殖分化来实现的;肿瘤源性外泌体可将肿瘤特异抗原提呈至DC，通过激活细胞毒T淋巴细胞从而产生有效的治疗和保护效应，且这种免疫效应不受MHC的约束[27].

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类广泛存在于机体多种组织中，具有自我修复和免疫调节能力的多向分化潜能非造血祖细胞，目前广泛应用于多种疾病的研究中[28，29].MSCs通过细胞旁分泌方式释放的外泌体参与一系列生理病理过程，同时对免疫系统也起着重要的调节作用.叶涛等研究发现外泌体联合Wnt3a蛋白可定向诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化及归巢，促进成熟肉芽组织沉积，加速创面血管形成，进一步促进组织创面修复.2013年，Bruno等[30]研究发现MSCs源性的外泌体可以抑制肝癌（HepG2）、Kaposi肉瘤、卵巢癌、（Skov-3）细胞体内体外的增殖以及生长.虽然目前还未有MSCs源性外泌体在胰腺癌中的相关研究报道，但外泌体在机体免疫应答、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等过程中发挥的作用是毋庸置疑的，笔者相信随着对MSCs源性外泌体修复特性及多向分化潜能的不断深入研究，必将为胰腺癌患者带来新的治疗前景.

4.2 外泌体作为载体在胰腺癌中的应用 外泌体作为机体自身分泌的一种囊性小泡，具有低免疫原性、稳定性高、渗透性好、具有一定靶向性等特点，在体外实验中也发现，胰腺癌细胞可以主动摄取人工置入的外泌体，并诱导细胞毒性反应[31]，因此外泌体可作为机体天然的内源性载体.目前外泌体可携带的物质包括（1）基因（mRNA、miRNA、siRNA）当体内其他细胞摄取这些含有RNA的外泌体后，通过其在受体细胞中翻译表达及调控相应蛋白质合成而发挥抗肿瘤作用[32];（2）蛋白和抗原;（3）化疗药物，如多柔比星和姜黄素利用外泌体达到靶向的作用[33];（4）一些免疫调节剂，如白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、白细胞介素-18（interleukin-18，IL-18）等，可刺激机体免疫系统对抗肿瘤细胞而非在肿瘤细胞诱导下的免疫抑制.此外有研究表明，通过改变肿瘤微环境的pH值或者干扰与肿瘤外泌体分泌相关的信号传导通路，可抑制外泌体介导的药物外排，从而更好的发挥药物的作用.

4.3 外泌体在胰腺癌转化治疗耐药中的机制及作用 转化治疗是局部进展期胰腺癌治疗的重要手段之一，然而胰腺癌对化疗药物敏感性差且易产生耐药性，因此，探讨胰腺癌的耐药机制，进而寻求克服或逆转肿瘤耐药的方法尤为重要.胰腺癌微环境是肿瘤发生、发展和转移的局部病理环境，其内包含大量肿瘤相关免疫细胞及肿瘤源性、基质细胞源性外泌体，此类外泌体内含有多种生物活性物质如核酸（DNA、lncRNA、miRNAs、mRNAs）、蛋白质、脂质等，通过释放其内容物增强肿瘤细胞表型或诱导肿瘤细胞产生耐药性.（1）Richards等[34]在胰腺癌患者吉西他滨化疗过程中发现CAFs可通过分泌外泌体来提高snail和miRNA-146a基因的高表达，从而促进胰腺癌上皮细胞产生耐药性;（2）外泌体脂质一方面可通过CXC趋化因子受体4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）/基质细胞衍生因子1α（stromal cell-derived factor 1α，SDF1α）信号通路诱导人胰腺癌细胞产生耐药性[35，36];另一方面还可通过抑制Notch1途径直接诱导人胰腺癌SOJ-6细胞凋亡[37，38];（3）凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）虽可促进肿瘤细胞的凋亡，但其在多种肿瘤细胞中的表达水平明显不足[39].来源于胰腺癌的外泌体中含有IAP的相关mRNA，通过抑制IAP的表达使化疗过程中胰腺癌细胞质中IAP蛋白或mRNA的水平基本保持不变或中度上调，进而增强胰腺癌细胞对化疗药物的耐药性.miRNA-155是一个典型的多功能miRNA，通过促进过氧化氢酶和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等活性氧解毒酶的高表达，以提高化疗过程中胰腺癌细胞的存活率和耐药性[40].以上众多研究均表明外泌体有促进肿瘤细胞耐药的特性，利用这一特性可提高肿瘤治疗的疗效.一方面利用外泌体对药物产生的抵抗作用，当移除肿瘤中的某种耐药性外泌体后，可能会提高肿瘤的治疗效果.CAFs占据了胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinomas，PADC）的主要部分，研究者通过应用抑制CAFs释放外泌体的药物后发现共培养的上皮细胞存活率明显下降，表明CAFs外泌体是PDAC细胞化疗耐药的关键调节者，通过阻断其释放可降低PADC细胞存活率，从而规避对化疗药物的耐药性，进而提高肿瘤治疗的敏感性[41，42].另一方面，利用外泌体作为载体传递抗miRNA或通过抑制外泌体释放来逆转肿瘤耐药性从而提高化疗疗效[43].

5 胰腺癌的预后与随访

胰腺癌手术切除率低，术后易复发转移，预后极差，死亡率高.研究表明在胰腺癌细胞发生转移前，可分泌多种外泌体到周围微环境中或释放到血液循环中至远隔器官内，干预和改变远隔器官的预转移微环境（premetastatic niche）的形成[44，45].因此外泌体可用于胰腺癌的预后观察，相比于其他肿瘤标记物，其敏感性高，能够早期预测肿瘤发生.在血清外泌体对胰腺癌细胞的诊断研究中发现，外泌体中lncRNA CCAT1检测胰腺癌的敏感度、特异性和准确性方面均显著高于CA19-9（P＜0.05），可作为预测胰腺癌患者预后不良的独立危险因素[46].此外，Jung等[47]研究表明来源于胰腺癌的富含CD44v6的外泌体，与胰腺癌淋巴结及肺组织的早期转移有关.

随着物联网时代的快速发展，建立外泌体与胰腺癌及高危人群的随访电子档案，通过应用大数据、微信等电子媒介设备，绑定患者住院及治疗信息，可实时了解患者病情变化，并可加强对出院患者的远程诊疗.

6 总结与展望

研究外泌体在胰腺癌诊疗中的应用，以期提高胰腺癌的早期诊断率、提高R0切除率、改善胰腺癌对吉西他滨等化疗药的耐药性，进而提高5年生存率.

越来越多的研究表明外泌体作为一种新型生物学标志物在胰腺癌早期诊断和病情监测方面有着巨大潜在价值，其作为胰腺癌化疗药物的运送载体亦有着极具潜力的研究前景;然而目前关于外泌体在胰腺癌中的研究仍处于基础阶段，虽然外泌体的提取方法很多，但尚无一种方法能同时保证其含量、纯度和生物活性;受制于技术手段等方面原因外泌体还未真正进入临床应用，笔者相信随着研究的不断深入及技术条件的完善，外泌体终会发挥其应有价值，为胰腺癌患者的治疗带来新的希望.