微小RNA 在子宫内膜异位症中的研究进展

曹敏，张广美

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是育龄期女性最常见的妇科疾病之一，据估计EMs 在育龄期妇女中发病率为10%～15%[1]，其特征为有活性的子宫内膜组织（腺体或间质）种植于子宫腔以外的部位，临床上通常表现为疼痛、不孕、性交不适、月经异常、消化系统及泌尿系统异常等症状，虽为良性疾病却在行为学上表现为恶性生物学特征。尽管有几种假说试图解释EMs 的发生原因，但根本机制仍不清晰，并不能解释90%的女性存在经血逆流现象而仅有10%左右发展为EMs，预示着EMs 的发生、发展过程中可能存在着其他调控机制。最近，微小RNA（microRNA，miRNA）在EMs 的发病机制中起到的作用日益引起重视。miRNA 是一类长约22 个碱基的内源性非编码RNA 分子，通过不完全碱基互补的方式与靶基因mRNA 的3′非编码区（3′untranslated region，3′UTR）结合，完成对靶基因mRNA 的抑制、关闭，进而实现对基因的负调控作用[2]。有研究检测到EMs 患者的在位内膜、异位内膜、血清中miRNA的表达与正常女性均存在差异，现就miRNA 与EMs的病理生理学研究新进展进行综述。

1 miRNA调节细胞的增殖和凋亡

细胞的增殖与凋亡受多种基因的复杂调节，任何一方失控都能导致机体功能障碍和疾病发生，异常增殖及凋亡抑制是EMs 异位病灶在盆腔内存活甚至发生远处转移的重要因素，以下miRNA 均有可能参与这些基因的调控与表达。

1.1 miR-503Hirakawa 等[3]通过结合亚硫酸氢钠变性的限制性酶分析（combined bisulfite restriction analysis，COBRA）发现，子宫内膜异位囊肿基质细胞（endometriotic cyst stromal cells，ECSCs）受到DNA 超甲基化影响而出现miR-503 表达下降。将miR-503转染到ECSCs 中，发现miR-503 可通过抑制细胞周期蛋白D1 并诱导G0/G1 期的细胞周期停滞抑制细胞增殖，通过抑制B 细胞淋巴瘤2（Bcl-2）基因促进细胞凋亡。Bcl-2 是在子宫内膜和基质均表达的一种原癌基因，具有重要的抑制凋亡作用。文晓凤等[4]用免疫组织化学法发现Bcl-2 表达水平在子宫内膜增殖期增加，在分泌期降低，异位内膜组织较正常内膜组织中的Bcl-2 表达明显增加，这些差异性表达为异位内膜组织中miR-503 低表达致Bcl-2 水平升高而抑制凋亡的猜想提供了依据。Taghavipour 等[5]认为Bcl-2 的这种抑制凋亡作用主要通过抑制促凋亡蛋白[如Bcl 相关的X 蛋白（Bax）、Bcl 样蛋白（Bcl-X）和Bcl-2 同源拮抗物（Bak）等]发挥作用。Lai 等[6]通过电子自旋共振（electron spin resonance，ESR）技术证实了Bax 在促进凋亡方面的重要性，当细胞受到各种因素刺激后，Bax 等在凋亡过程中被激活，从胞质溶胶转移到线粒体外膜并寡聚，使线粒体外膜发生实质性结构变化，实现线粒体外膜透化（mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP），使线粒体释放的凋亡因子通过而触发凋亡。

1.2 其他miRNA研究证实多种miRNA 参与异位子宫内膜细胞增殖，并在EMs 患者中差异表达。Zhao 等[7]发现与正常子宫内膜相比，EMs 异位内膜中孤儿核受体/miR-181c/哺乳动物STE20 样激酶1（NR4A/miR-181c/Mst1）信号通路发挥着重要作用，异位内膜组织中NR4A/miR-181c 高表达，Mst1 表达量显著下调，其中Mst1 具有增强线粒体分裂蛋白Drp1 转录后Ser616 位点磷酸化、通过p53 抑制Parkin 基因转录活化和启动半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Capase9）等作用，激活线粒体分裂和抑制自噬，推测该通路抑制了异位内膜细胞凋亡。Hu 等[8]发现用miR-370-3p 模拟物转染原发性子宫内膜异位细胞会导致类固醇生成因子1（steroidogenic factor-1，SF-1）和其下游靶基因类固醇生成急性调节蛋白（StAR）和芳香化酶（CYP19A1）的表达改变，促进异位内膜组织凋亡，证实EMs 患者血清中miR-370-3p 水平降低而EMs 病变中SF-1 mRNA 水平上调，可促进异位内膜细胞增殖并抑制其凋亡。

2 miRNA 与细胞黏附及侵袭

脱落的子宫内膜细胞需经过三重防线进入腹腔，然后在腹膜、盆腔脏器，甚至肾、脑等远处器官植入并产生功能损害，这与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）防御作用减弱、异位内膜细胞黏附侵袭能力增强密切相关。

2.1 核因子κB（NF-κB）Wu 等[9]证实外源性miR-199a 可在子宫内膜间质细胞中靶向抑制NF-κB 激活所需辅因子IκB 激酶β（IKKB），从而抑制NF-κB 活化。多项研究证实miR-199a 在异位子宫内膜细胞中表达减少，对NF-κB 的抑制活化作用减弱，影响细胞因子的表达，如白细胞介素10（IL-10）过表达并激活基质金属蛋白酶（MMP），导致ECM 过度降解，促进子宫内膜基质细胞的侵袭，证实miR-199a 低表达可使异位子宫内膜间充质干细胞（EN-MSCs）在体内外均具有较高的细胞侵袭能力[10]。Zheng 等[11]证明异位内膜组织中高表达的miR-9-5p 通过NF-κB 通路靶向沉默信息调节因子1（SIRT1）的表达，促进子宫内膜间质细胞的侵袭和迁移，通过试验性调整miR-9-5p 的表达量，进一步发现子宫内膜间质细胞迁移的距离以及进入Transwell小室下腔的细胞数量与之呈正相关，从而证明了miRNA 在促进异位内膜细胞黏附与侵袭方面的作用。

2.2 其他miRNA异位内膜黏附种植于腹腔脏器，并完成侵袭及远处转移是EMs 重要的恶性特征性表现，是复发的重要病理学基础，很多miRNA 发挥了不可忽视的作用。Wang 等[12]通过体外实验证实，环状RNA circATRNL1 过表达可促进内膜细胞的迁移和侵袭，并诱导异位病灶形成，而circATRNL1 的沉默则表现出相反的作用，并进一步解释其原因为高水平表达的circATRNL1 负向调控miR-141-3p 和miR-200a-3p，使其共同的下游靶基因yes 相关蛋白1（yes-associated protein 1，YAP1）过表达，促进异位内膜细胞的黏附与侵袭。Mai 等[13]研究发现，miR-506-5p 在异位内膜组织中高表达并通过抑制WNT 抑制因子1（WNT inhibitory factor 1，WIF1）表达激活Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）途径，β-catenin 是转录因子家族的协同激活因子，与其结合后可启动下游靶基因的转录，促进细胞的增殖从而诱导异位内膜细胞的迁移和侵袭。

3 miRNA 与血管生成

EMs 发病机制尚未明确，多数学者认为新生血管生成在脱落子宫内膜的异位定植过程中发挥重要作用，近年来发现多种miRNA 可以调控血管生成。

3.1 血管内皮生长因子（VEGF）VEGF 是一种高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂素，具有增加血管通透性，促进血管内皮细胞迁移、增殖和血管生成等作用，其中VEGFA 为主要发挥生物学作用的一个最关键亚型。Chamorro-Jorganes 等[14]用细胞转染技术证明miR-16-5p 和miR-424-5p 直接靶向VEGF、VEGF 受体2（VEGFR-2）和成纤维细胞生长因子受体1（FGFR-1），使模拟转染后VEGF、VEGFR-2 和FGFR-1 的表达显著降低，而这些miRNA 的拮抗剂则表现为相反作用，由此推测这两种miRNA 在异位内膜中的低表达促进内皮细胞血管生成。俞田田等[15]用微小RNA 阵列（miRNA array）芯片检测孕早期妊娠丢失患者蜕膜组织中差异表达的miRNA，发现miR-125a-5p 和miR-29c-3p 差异性表达上调最为明显，进一步应用靶基因技术推定两者均通过对VEGFA 的调控影响子宫内膜蜕膜化血管重塑的过程，参与流产发生。Ma 等[16]通过研究证实子宫内膜异位组织中miR-200b、miR-15a-5p和miR-142-3p 的表达降低，其中miR-142-3p 直接靶 向Krüppel样因子9（KLF9），KLF9可直接与VEGFA 基因的启动子结合，使VEGFA 表达水平升高，腹腔注射miR-142-3p 慢病毒或敲除KLF9 均可显著抑制新生血管形成，因此，miR-142-3p/KLF9/VEGFA 信号通路可能是减少EMs 患者新生血管形成的潜在治疗靶点。

3.2 血管生成素1（angiopoietin-1，Ang-1）刘敏娟等[17]通过芯片测序发现miR-96 在EMs 患者的子宫内膜中高表达，且miR-96 可特异性靶向Ang-1 基因的3′UTR 区，促进Ang-1 的表达，促进血管的重塑、成熟及稳定。据此推测miRNA 可作用于多种靶点，促进子宫内膜异位病灶的血管生成与植入。

4 miRNA 与免疫和炎症

研究发现EMs 患者腹腔内可检测到多种类型的免疫细胞，形成了复杂的炎症性微环境，这种微环境有利于内膜细胞的种植与EMs 病灶的形成；EMs病灶切除术后，腹腔内炎症状态可明显改善，这为EMs 病灶促进炎症因子分泌的猜想提供了证据。

4.1 炎症促进EMs 发展微环境中长期存在的慢性炎症会诱导免疫抑制细胞积累，出现T 细胞质量受损表现，如辅助性T 细胞1/辅助性T 细胞2（Th1/Th2）失衡、CD4+T 细胞生成一氧化氮（NO）增加，T 细胞受体（T cell receptor，TCR）z 链水平降低，促进EMs炎症的发生和疾病的进展[18]。Chen 等[19]研究表明炎性细胞因子和外泌体miRNA 可能与EMs 的发展关系密切，普遍认为外泌体miRNA 是炎症和T 细胞免疫反应的介体，晚期EMs 患者腹腔液中可检测到多种外泌体miRNA 表达改变、调节性T 细胞（Treg）扩增，其中miR-451a 上调尤为显著，这些外泌体可能导致腹腔内炎症环境的形成与免疫异常，为EMs 病灶的定植与血管生成提供了可能。

4.2 EMs 异位病灶促进炎症发生EMs 异位病灶直接或间接地改变了患者的腹腔内微环境。有学者证实EMs 患者的腹腔液和腹腔内CD14 单核细胞/巨噬细胞中miR-146b 的表达增加，miR-146b 通过减弱干扰素调节因子5（interferon regulatory factor 5，IRF5）表达参与了炎症的负调控[20]。Tang 等[21]发现miR-455 在EMs 患者的异位内膜组织中低表达是腹腔内炎症损害的重要原因，并进一步推定其是脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4，FABP4）的靶向miRNA，并进一步证实miR-455 可以成功结合FABP4 的3′UTR 保护子宫内膜基质细胞免受过氧化氢（H2O2）引起的损害。

5 miRNA 与不孕

EMs 患者不孕原因与子宫内膜容受性降低、免疫异常等原因密切相关，应着眼于多种因素寻找突破点提高患者妊娠率[22]。众多学者通过研究人体组织与小鼠模型证实EMs 患者的分子标志物已发生改变，多种miRNA 参与妊娠调节。

5.1 容受性降低子宫内膜容受性是指子宫内膜对植入胚胎的接受能力，只出现于每个月经周期中的特殊时期，是一种综合性状态，其中包括子宫内膜厚度、形态以及血流分布等，受多种因素复杂调控。Petracco 等[23]认为miR-135a/b 的表达与子宫内膜容受性有关，分泌期子宫内膜miR-135a/b 的表达水平比增殖期高，EMs 患者miR-135a/b 的表达水平比正常育龄期女性少。由此可推测其在生殖组织的稳态中起正向决定性作用。但另有研究证实，EMs 相关性不孕妇女着床窗口期原位子宫内膜组织中5 个差异表达的miRNA（miR-142-5p、miR-146a-5p、miR-1281、miR-940 和miR-4634）显著上调，而miR-543显著下调，从而猜测这些miRNA 的表达改变可能会影响胚胎植入[24]。这些miRNA 的表达异常均有可能影响子宫内膜功能，损害胚胎植入从而导致EMs 相关性不孕的发生。

5.2 孕酮抵抗多数EMs 患者对孕酮治疗呈现低反应或无反应，称之为孕酮抵抗。Pei 等[25]发现miR-194-3p 在轻度EMs 患者的子宫内膜组织中过表达，其通过促进细胞形态学变化和调整催乳素水平来抑制胚胎干细胞的体外蜕膜化。进一步研究证实miR-194-3p 导致EMs 患者孕酮抵抗是通过抑制孕激素受体（progesterone receptor，PGR）的水平和在位子宫内膜中的蜕膜化来阻碍生育。Zhou 等[26]认为miR-196a 过表达同样可导致孕酮抵抗，EMs 患者内膜组织中miR-196a 水平显著上升，其通过上调细胞外调节蛋白激酶激酶/细胞外调节蛋白激酶（MEK/ERK）信号通路与抑制PGR 表达来阻碍子宫内膜蜕膜化，导致EMs 患者妊娠率下降。

6 miRNA 与EMs 的治疗

目前EMs 发病机制尚不清晰，缺乏特异性诊断标志物，诊断主要依靠于腹腔镜，所以存在着延迟诊断以及延误治疗，其虽为良性疾病却严重影响妇女的健康与生活质量。目前EMs 的治疗方式主要为手术治疗，miRNA 治疗仍缺乏临床证据，但很多学者从此方面提供了思路，为临床诊断与治疗提供了更为广阔的思路。

Li 等[27]通过3′UTR 荧光素酶的报告基因测定结果推测miR-92a 转染后的高表达可降低第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten gene，PTEN 基因）水平，使基质细胞对孕酮治疗更具抵抗力。另一方面使用miRNA 拮抗剂（antagomir）抑制miR-92a 的作用可增强孕酮的治疗效果，抑制基质细胞增殖，并减少EMs 小鼠模型中异位病灶的形成。另有学者证实miR-200c 受转移相关肺腺癌转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）的负向调控，抑制人子宫内膜基质细胞的增殖和迁移，局部注射miR-200c 模拟物或行MALAT1 敲除均可显著抑制异位子宫内膜病变的生长[28]。Park 等[29]发现EMs 患者子宫内膜中miR-21-5p 的表达明显上调，用皂苷提取物处理人子宫内膜基质细胞后miR-21-5p 的表达下降导致Caspase3的表达显著增加，进而促进了内膜细胞的凋亡。由此推测，皂苷提取物可能通过调节特定的miRNA 来治疗EMs。

7 结语

miRNA 与EMs 具体的发病机制之间的关系尚未得到准确充分的认识，全面分析EMs 的发病机制可对临床不孕患者的治疗起到指导作用。miRNA 之间的关系错综复杂，一种miRNA 可能作用于多种信号通路、靶位点，一种靶位点可能受多种miRNA调控，这种复杂的网状通路的形成促进了EMs 的发生、进展。单从某一个方面着手进行治疗，往往得不到预想的结局。EMs 至今无法根治，对患者生活质量造成的不良影响也缺乏有效的干预手段，目前临床医生应着眼于多种复杂性机制网，根据不同情况采取个体化治疗措施、长期管理、对症治疗，改善患者生活质量，提高患者妊娠率。