circRNA-miRNA-mRNA调节网络在疾病研究中的进展

王 嵩，黄思捷，郤 庆 综述，李国文，沈朝斌 审校

环状RNA(circular RNA,circRNA)成为近年来研究的热点，是继微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)之后一种新型非编码RNA。circRNA在细胞中广泛地表达，具有高度稳定及保守的特性。随着生物信息技术的快速发展，越来越多的circRNA被报道，并成为新的研究靶点。circRNA分子能够选择性地调节细胞转录、与miRNA相互作用等。circRNA的表达与多种疾病密切相关，一些circRNA可能通过调节miRNA的表达起到miRNA海绵的作用。miRNA是一类由长度约22个核苷酸组成的非编码单链RNA，它参与动、植物转录后基因表达的调控。circRNA-miRNA-mRNA网络是一些疾病的相关调节模式，circRNA可作为miRNA海绵发挥作用，并调节下游相关mRNA。本文中，我们讨论了目前对于circRNA的理解以及通过circRNA-miRNA-mRNA网络在疾病中的作用作一阐述。

1 circRNA的生物学特征

circRNA最早由SANGER等[1]在植物类病毒中发现并提出的。随着高通量测序等技术的发展，相继在人、动物、植物等多种生物中检测出数千种circRNA，并且数量还在不断增加。大部分circRNA存在于细胞质，小部分存在于细胞核中[2-4]。不同细胞中的circRNA表达水平存在差异，但高于同一来源的线性RNA的表达[5]。目前，尽管一些研究发现circRNA可以通过结合miRNA在调节相应线性mRNA的活性中起到作用，但是在circRNA及其相应的线性转录物之间尚未发现功能方面的特定关联。circRNA不同于线性RNA，它是由一个外显子3′端和另一个外显子5′端通过共价结合形成的一个闭合环形结构。由于缺乏加帽结构及缺少自由端，因此不易被核酸外切酶降解，无法被翻译成蛋白，具有较强的稳定性[6]。大多数外显子circRNA的半衰期超过48 h，而mRNA的平均半衰期为10 h[7]，因此，它是诊断及治疗疾病潜在的分子标志物。

研究[8]发现多种circRNA在特定的组织中如脑及血液中高表达。一些circRNA还会随着发育的不同阶段发生改变，其表达随着年龄的增长而变化，GRUNER等[9]发现22月龄的小鼠大脑中，circ_004501和circ_013636的表达较12月龄增高。

2 circRNA主要的功能

2.1 miRNA海绵作用 miRNA是转录后水平基因表达的关键调节因子，circRNA含有miRNA的结合位点，因此可竞争性分离、结合miRNA，充当miRNA的海绵，从而起到降解靶向mRNA的作用，间接控制基因的表达[10]。研究[11-12]发现有包括circACVR2A、has_circ_0002577等在内的多种circRNA具有miRNA海绵作用。主要分布于细胞质中的circACVR2A在膀胱癌细胞和组织中低表达，这与膀胱癌病人的不良临床病理特征相关。circACVR2A可与细胞中的miRNA-626相互作用，其过表达能拮抗miRNA-626介导的膀胱癌细胞中细胞增殖、迁移和侵袭能力的增强，表明circACVR2A可以作为miRNA-626的海绵来调节EYA4基因的表达，可作为膀胱癌潜在的生物标志物和治疗靶点[11]。在对has_circ_0002577的研究中发现，hsa_circ_0002577高表达于子宫内膜癌组织中，与淋巴结转移和子宫内膜癌病人的总体存活率相关。hsa_circ_0002577可能是与miR-197相结合，通过其靶基因CTNND1发挥作用，调节细胞的增殖、迁移、侵袭能力，最终降低体内肿瘤的生长。该研究推测hsa_circ_0002577可以通过hsa_circ_0002577/miR-197/CTNND1/Wnt/β-catenin信号通路发挥关键功能，作为子宫内膜癌治疗的新型治疗应用[12]。circRNA在基因不同位置有不同的表达，它们也可以作为miRNA介导的转录调控网络的重要组成部分。

2.2 调控亲本基因的表达 非编码RNA的一个主要作用是调控亲本基因的表达，不同类型的非编码RNA的调控机制各有不同。circRNA能与RNA结合蛋白结合，影响其亲本基因的表达。在circRNA的形成过程中，内含子间通过竞争性互补影响mRNA的表达以及蛋白质的转录。相关研究预测了一些环状内含子RNA或外显子-内含子circRNA可作为基因表达的转录后调节因子，调节线性RNA的转录和蛋白的表达，丰富的circRNA以未知的机制促进其亲本基因的转录；同时外显子-内含子circRNA定位于细胞核内，结合核糖蛋白复合物来上调特定基因，并使其形成circRNA反向链接过程中的各种转录。circRNA通过与特异性RNA聚合酶Ⅱ的相互作用，促进相关亲本基因的转录。此外circRNA可以结合转录机制之外的蛋白质来调节其细胞功能，如内含子circRNA通过结合来影响肌萎缩侧索硬化中退化的运动神经元中TDP-43蛋白的聚集。因此认为circRNA的转录可竞争性地抑制其亲本基因mRNA的形成[12-13]。

2.3 蛋白编码调控 作为一种非编码RNA，circRNA由于其特殊的结构，无法提供适合的核糖体进入位点，被认为无法进行翻译。但从1995年起就有研究发现，外源性circRNA可以募集核糖体，进入位点后启动翻译机制，将对应的蛋白质进行翻译[14]。ZHANG等[15]在肺腺癌组织筛选中发现，高表达的circ_0007766可以上调细胞周期的关键蛋白Cyclin D1/Cyclin E1/CDK4的表达，细胞周期在G0/G1期停滞，但细胞凋亡未受影响，从而促进肺腺癌的恶性增殖。circRNA_104075的过表达抵消了中药苦参碱对细胞增殖的抑制作用，并促进神经胶质瘤U251细胞对细胞凋亡和自噬的作用，被抑制的Wnt/β-catenin和PI3K/AKT信号通路被circRNA_104075过表达激活[16]。

3 circRNA-miRNA-mRNA网络在疾病中的应用

由于circRNA可与疾病相关的miRNA、蛋白、基因等相互作用，引起异常的表达。circRNA异常表达会通过circRNA-miRNA-mRNA调节网络参与相关致病基因的表达，影响疾病的信号转导。通过细胞中circRNA、miRNA和mRNA的差异表达进行筛选，进行生物信息学分析，并获得与疾病相关的各类RNA。由于circRNA可作为海绵吸附miRNA并影响其表达，miRNA的调整会引起下游靶基因的上调。部分研究以差异性表达的miRNA为核心，下游靶基因通过靶向预测与差异性表达的mRNA进行匹配，得到靶向关系的miRNA-mRNA。通过筛选得到上游circRNA，并最终得到相对应的circRNA-miRNA-mRNA通路，对下游的mRNA及其蛋白进行更深入的研究，挖掘circRNA的潜在作用[17]。

3.1 心脑血管疾病 心脑血管疾病是全球死亡的主要原因。包括lncRNA、circRNA和miRNA的非编码RNA，通过各种机制参与心脑血管的病理发展。动脉粥样硬化是心血管疾病的重要致病因素之一，ZHANG等[18]为了探索circRNA在动脉粥样硬化中的功能，研究了3只动脉粥样硬化模型兔的circRNA、miRNA和mRNA的表达谱，构建了差异表达的circRNA-miRNA-mRNA的网络图，通过生成一个circRNA相关的内源竞争RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)网络，发现了7个circRNA(ocu-cirR-novel-18038，-18298，-15993，-17934，-17879，-18036和-14389)与粥样动脉硬化有关，这些circRNA参与了细胞黏附、细胞活化和免疫反应。证明了circRNA通过在动脉粥样硬化的发病机理中竞争性共享miRNA而充当ceRNA来调节miRNA。因此circRNA-miRNA-mRNA网络在动脉粥样硬化中可能扮演着重要的角色。TIAN等[19]通过高通量RNA测序研究发现，在人类急性Stanford A型主动脉夹层的病人中存在506个circRNA显著失调，酪氨酸受体激酶Fgr在其中起重要的作用。通过差异性表达发现Fgr的上游调节分子circMARK3，可作为该疾病诊断的潜在生物标志物。评估血清中circMARK3和miR-1273-3p的表达，能进一步提高诊断的灵敏度和特异性。

3.2 骨骼疾病 SHEN等[20]对猪骨骼肌中的lncRNA和circRNA的表达进行全基因多样性分析，鉴定出差异性表达的111个lncRNA和137个circRNA参与了糖酵解、氧化还原和ATP代谢。进一步发现circRNA290-miR27b-Foxj3和circRNA9210-miR-23a-MEF2C两个竞争性网络与肌肉纤维的转换密切相关。XIAO等[21]通过illumine测序平台对骨关节炎病人的膝关节髁中的circRNA的表达，共鉴定出hg_circ_0007474等197个差异性表达的circRNA，21个目标miRNA和2 466个相关基因，其中hsa_circ_0045714、hsa_circ_0002485和hsa_circ_0005567三个circRNA与该疾病密切相关。成骨细胞的形成与破骨细胞的吸收动态维持骨稳定。在破骨细胞过度活化诱导骨稳定态失调的研究中，RANKL+CSF1处理后的破骨细胞显著诱导circRNA_28313的表达。circRNA_28313的敲除会抑制RANKL+CSF1诱导的骨髓单核细胞/巨噬细胞内破骨细胞的分化。因此circRNA_28313被认为通过充当ceRNA缓解miR-195a介导的对CSF1的抑制，来调节破骨细胞的分化，影响卵巢切除诱导的小鼠骨吸收[22]。此外骨形态蛋白2通过circ19142/circ5846靶向的miRNA-mRNA网络诱导成骨细胞分化。hsa_circ_0005846和has_circ_0019142分别与51和21个miRNA相互作用，并且都充当miR-70675p的海绵，此外它们还参与了FGF、EGF、PDGF和Wnt信号通路[23]。

3.3 肿瘤 由于circRNA可与肿瘤相关的miRNA、基因等相互作用，其异常表达会引起癌变。circRNA的异常表达通过circRNA-miRNA-mRNA影响细胞周期。药物控制是肝细胞癌病人的重要治疗方法，XIONG等[24]通过构建circRNA-miRNA-mRNA网络，发现has_circRNA_100291和has_circRNA_104515可以作为ceRNA在肝细胞癌中发挥关键作用，在此基础上确定了7个基因(JUN、MYCN、AR、ESR1、FOXO1、IGF1和CD34)，并将地西他滨、吉非替尼和BW-B70C确定为肝细胞癌的治疗药物。XIAO等[25]通过该网络图谱鉴定出4个关键基因，并筛选出对胰腺导管腺癌有潜在治疗价值的南蛇藤醇等3种活性物质。CHENG等[26]首先发现了miR-124和miR-29b与胃癌中的circHIPK3表达相关，miR-124和miR-29b在胃癌病人中表达持续下调，circHIPK3对miR-124/miR-29b的表达起负调节作用，并抑制胃癌细胞的增殖。通过筛选circHIPK3对miR-124/miR-29b网络中的共同靶标，确认COL1A和COL4A1两种人类胶原蛋白基因为胃癌病人预后的生物标志物。在对102个原代胃癌组织中的ciRS-7的表达水平进行评估并验证发现，作为miRNA-7海绵的ciRS-7的表达显著上调，过表达的ciRS-7阻断的miR-7诱导的肿瘤，通过拮抗miR-7介导的PTEN/PI3K/AKT途径抑制MGC-803和HGC-27细胞，并导致更具侵袭性的致癌表型[27]。XIA等[28]在前列腺病人中发现了1 021个差异表达的circRNA，其中circ_0057558与总胆固醇呈正相关。通过circRNA-miRNA-mRNA网络分析发现，circ_0057558和circ_0034467调节miR-6884的表达，而circ_0062019和circ_0060325影响miR-5008的表达。因此推断circ_0062019和circ_0057558的差异性表达与宿主基因SLC19A1可用作前列腺癌的标志物。在乳腺癌病人MCF-7细胞中，has_circ_0011946的海绵miR-26a/b直接靶向基因RFC，敲除该基因可抑制RFC3 mRNA和蛋白的表达，has_circ_0011946/RFC3信号通路的失活可显著抑制MCF-7细胞的迁移和入侵[29]。由于circRNA的高稳定性，因此将circRNA的异常表达作为治疗靶点或标志物，可作为检测和治疗癌症的新的有效途径。

3.4 其他疾病 QIAN等[30]在系统性红斑狼疮病人中发现，circPTPN22的亲本基因PTPN22是T细胞活化的有效调节剂。circPTPN22的下调与其系统性红斑狼疮疾病活动指数评分呈负相关。评分较高的病人circPTPN22表达水平较低，长期激素治疗会显著增加circPTPN22的水平。非酒精性脂肪性肝炎被认为是非酒精性肝病的重要阶段，肝细胞中的脂质沉淀而没有酒精过度消耗，但其详细机制尚不明确。JIN等[31]通过蛋氨酸和胆碱缺乏症饮食建立非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型。最初通过微阵列筛选肝脏circRNA和mRNA谱，随后进行qRT-PCR验证。通过qRT-PCR验证重叠预测的miRNA作为circRNA的下游靶标和mRNA的上游调节子，构建了circRNA_002581-miR-122-Slc1a5，circRNA_002581-miR-122-Plp2，circRNA_002581-miR-122-Cpeb1和circRNA_007585-miR-326-UCP四种circRNA-miRNA-mRNA途径，但目前仅基于动物模型阶段。黄斑变性与年龄密切相关，SU等[32]构建了具有303个circRNA节点，4个miRNA节点和51个mRNA节点的circRNA-miRNA-mRNA网络，通过分析确定了hsa_circRNA9329/hsa_miR-9/SCD的调控轴，促进巨噬细胞介导的炎症和病理性血管的形成，从而导致的黄斑变性的发生。在对脓毒症诱导的肺损伤后的巨噬细胞极化作用的研究中发现，上调的circRNA参与多种生物学功能，如调节线粒体分布和Notch结合，而下调的circRNAs主要参与生物学过程中组蛋白H3K27的甲基化，TGF-β信号通路与上调的circRNA有关[33]。

4 小结与展望

随着高通量测序与生信技术的快速发展，在组织中发现了多种具有稳定结构特征的circRNA，涉及到不同的细胞过程，包括生长、衰老、凋亡等。已经确定的一些与各疾病相关的失调的circRNA的表达谱，通过circRNA-miRNA-mRNA网络，可将其作为疾病的临床诊断标志物和靶向药物的寻找工具。尽管对于circRNA的研究和认识以及构建的circRNA-miRNA-mRNA还较为局限，随着研究的深入，在未来人类疾病信号通路中具有更为新颖的作用。