棉花耐盐性研究进展*

王俊铎，黎玉华,龚照龙，梁亚军，艾先涛，郭江平，买买提·莫明，李雪源，郑巨云

(1.新疆农业科学院经济作物研究所，新疆 乌鲁木齐 830091；2.新疆博乐市种业发展中心，新疆 博乐 833400 )

新疆是我国最主要的棉花产区，新疆棉花生产直接影响我国棉花生产安全和棉花的有效供给。2018 年新疆棉花种植面积249.14万hm2，占全国总面积的74.31%，比2017年增长9.22%。2018年新疆棉花总产511.1万t，占全国的83.8%[1]。据统计，新疆盐碱土的面积为2 181.4万hm2，占全国盐碱土面积的22.01%，在新疆地区407万hm2耕地中，不同程度盐渍化的耕地达122.88万hm2，棉花的种植受到了较大的影响。研究棉花的耐盐胁迫机制，选育耐盐种质资源，挖掘盐渍化耕地的生产潜力在维持棉花增产、稳产中发挥重要作用，已成为高度关注的热点问题。因此，作者结合目前已报道的盐胁迫下棉花的生长发育、作用机制以及挖掘的相关耐盐基因，综述棉花的耐盐性研究情况，旨在充分利用和发挥棉花抗旱、耐盐、耐瘠薄的能力，推广盐碱地和瘠薄地植棉，保障棉花有效供给，促进棉花产业可持续发展。

1盐胁迫对棉花的影响

1.1盐胁迫对棉花种子萌发的影响

盐胁迫对植物种子萌发有抑制作用，在盐浓度(质量分数，下同)≤ 1.2%时，所有棉花品种萌发受到的影响差异较小；盐浓度≥1.2%时品种间发芽率出现差异，后期生长受到抑制；低浓度的NaCl能促进棉花种子萌发，而高浓度则显著抑制[2]。在NaCl、Na2SO4和Na2CO3+NaHCO3三种盐碱胁迫中，棉花种子发芽系数、日均发芽率、相对发芽指数、相对发芽势和相对发芽率随着盐分浓度増大均呈下降趋势；且相同浓度Na2SO4胁迫比NaCl胁迫更严重[3]。在盐胁迫下棉花种子发芽率、发芽势、胚根长、种子萌发后的生物量均明显下降，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)的酶活性显著降低，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量明显增加[4]。

1.2盐胁迫对棉花生长生理的影响

盐胁迫导致棉苗生物量减少，渗透调节物质、H2O2、MDA含量、电解质渗出率和O2-产生速率增加[5]。盐碱胁迫主要影响棉花的叶片K+/Na+比值、根长、地上部鲜重、地上部干重和叶片胞间CO2浓度，为了降低盐胁迫的伤害程度，可以适当添加棉粕，增加盐碱胁迫下棉花不同器官对K+的吸收，降低对Na+的吸收，维持盐碱胁迫下细胞内K+和Na+的平衡，从而显著促进棉花生长，提高叶片叶绿素含量和光合作用效率，有效缓解盐碱胁迫对棉花的伤害[6]。棉花叶片中的细胞器对盐分的敏感程度不同，最敏感的叶绿体，其次是线粒体，在胁迫初期幼苗子叶SOD活性较高，随着胁迫浓度增加，胁迫时间增长，SOD活性下降，导致叶片质膜通透性增加，从而危害叶细胞的膜系统，进而影响光合和呼吸作用[7]。利用 NaCl、Na2SO4以及NaCl+NaHCO3(物质的量1∶1)混合成的中性盐对海岛棉进行处理，发现高盐浓度下，海岛棉株高、根系生物量及茎叶生物量与盐浓度呈显著负相关，且碱性盐对于海岛棉幼苗的伤害远大于中性盐[8]。NaCl胁迫过程中棉花叶片中的Na+通道蛋白、MAD含量增加；在使用油菜素内酯(Brassinolide，BR)后，棉花叶片中的Na+积累降低，脯氨酸含量增加，MDA含量降低，可以缓解NaCl胁迫，提高NaCl胁迫下棉花的生物产量[9]。

1.3盐胁迫对棉花品质的影响

盐胁迫对棉花的纤维细度、强度、成熟度影响较大。1986年Krth等研究发现NaCl胁迫过程中主要影响棉花分生组织细胞发育。叶武威[10]研究表明土壤中的盐分可以促进棉花纤维的增长，提高棉花纤维长度和降低马克隆值及细度，同时盐胁迫过程中棉铃发育受到抑制，铃重、种子重量有所下降，纤维中糖分含量增加，纤维素含量降低，含水量上升。这主要是由于胁迫过程中棉花生育期延长，棉铃内部渗透势小，铃壳失水、开裂早，花铃期缩短，导致棉铃及纤维发育不充分，糖分转化率下降。

2耐盐胁迫的相关基因

2.1离子转运相关基因

目前研究成果与离子转运相关的基因主要有两大类，一类是编码 Na+/H+逆向转运蛋白基因，另一类是编码 K+、Na+转运蛋白基因。在拟南芥中质膜Na+/H+反转运基因 AtSOS1 ，是SOS(The Salt Overly Sensitive)信号转导途径的一个组成部分。从陆地棉耐盐基因型中克隆了一个质膜Na+/H+逆向转运基因GhSOS1，在NaCl(200 mmol/L)胁迫过程中GhSOS1在棉花根系中的表达水平显著上调，GhSOS1蛋白定位于质膜，在拟南芥中的过表达，GhSOS1增强了拟南芥对盐胁迫的耐受性，表现为转基因植株中MDA含量降低，Na+/K+比值降低。此外，在GhSOS1高表达系中盐胁迫相关基因的转录水平显著高于盐处理的野生型植株；GhSOS1可能是提高转基因棉花耐盐性的潜在靶基因[11]。利用农杆菌介导转化系统，将质膜Na+/H+逆向转运基因K2-NhaD导入陆地棉R15中，K2-NhaD在温室条件下和盐碱胁迫下均过表达，使转基因棉花叶片的相对含水量、叶绿素、可溶性糖、脯氨酸水平以及SOD、CAT和POD活性显著高于非转基因棉花。从棉花cDNA文库中分离到一个GhNHX1，GhNHX1在酵母Na+/H+逆向转运突变体中表现为功能互补，过表达GhNHX1的转基因烟草植株也比野生型烟草具有更高的耐盐性。盐诱导下耐盐棉品种ZM3中GhNHX1 mRNA水平分别是盐敏感棉品种ZMS17和ZMS12的3倍和7倍[12]，GhNHX1的过表达在棉花的耐盐性中起着重要作用。

钾离子转运蛋白HAK/KUP/KT家族属于氨基酸多胺有机阳离子超家族，是一类具有二次活性的转运载体，在细菌、真菌和植物的跨膜转运中有着广泛的应用[13]。植物基因组中含有大量的HAK/KUP/KT转运蛋白基因，在K+吸收和转运、耐盐性和渗透势调节以及控制根系形态和地上部表型等方面发挥作用[14]。

2.2渗透调节相关基因

渗透调节相关物质主要有游离脯氨酸、MDA、可溶性糖(Soluble sugar)、甜菜碱(Betaine)等。脯氨酸是植物细胞应对非生物胁迫产生的一种有机化合物。在盐胁迫过程中，植物组织脯氨酸含量增加，清除O2-自由基，调节渗透压，保证细胞膜的完整性，防止质膜透性的变化。谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase，GSTs)是脯氨酸的合成底物谷氨酸的主要来源，研究发现含有柑橘谷胱甘肽转移酶(CSGSTUS)的转基因烟草具有一定的耐盐性，说明CsGSTUs的过表达有助于开发高抗非生物胁迫的转基因作物。盐胁迫过程中，植物叶片的丙二醛含量与其耐盐性呈负相关，这一结论在棉花、树木幼苗、番茄、马铃薯、菊芋、甜高粱、白刺和燕麦等作物中得到验证[16-23]，丙二醛的积累会导致O2-自由基离子增加，膜脂过氧化，植物耐盐性降低，丙二醛积累量越大，品种耐盐性越差[18, 24-26]。在盐胁迫过程中，耐盐性强的小麦叶片中可溶性糖含量高于耐盐性弱的品种[27]。在盐胁迫下小麦大量积累脯氨酸和可溶性糖等有机溶质[28]。在主要造林树种盐胁迫响应及耐盐机理研究中表明树木利用可溶性糖的积累来调节耐盐性[29]。甜菜碱可以有效地保护高等植物细胞膜的渗透势，Lai等将编码甜菜碱生物合成酶Mpgsmt和Mpsdmt的基因导入拟南芥并盐胁迫后表明，转基因植株表现出较强的耐盐性[30]。

2.3抗氧化性相关的酶基因

在盐胁迫过程中，植物组织中活性氧(ROS)增加，超氧化物歧化酶(SOD)可以有效清除ROS因子来提高植物的耐盐性，而CuZnSOD和抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidases，APX)是氧化应激引起的活性氧的第一道防御途径。Yan等将CuZnSOD和APX导入盐敏感甘薯，在盐胁迫下，野生型植株的生根明显受阻，而转基因植株均显著促进了根系的生长，且转基因植株的SOD、APX活性升高，说明CuZnSOD和APX对提高甘薯的耐盐性具有重要作用[31]。Negi等将AhCuZnSOD基因导入烟草，转基因烟草植株的SOD酶活性增加，增强了烟草的耐盐性[32]。Zhang等采用高通量测序技术研究了盐胁迫下坚果类植物的转录特性，表明在盐胁迫下植物激素信号通路的激活起着促进植物细胞保护和清除活性氧的两种主要抗氧化防御系统(即抗氧化酶和类黄酮)的作用[33]。

APX在植物抗氧化系统中发挥重要作用，是细胞水平调节抗氧化系统的关键因子。Duan等将番茄类囊体抗坏血酸过氧化物酶基因(LITAPX)导入到番茄中，LetAPX的过表达，番茄叶片中的还原型谷胱甘肽(Glutathione ，GSH)含量和叶绿素含量增加，APX活性增强，耐盐性增强[34]。Liu等将JctAPX 基因转入烟草，转基因植株叶绿素含量增加，APX 酶活性增强，耐盐性增加[35]。Shafi等研究表明，PaSOD和RaAPX过表达不仅在氧化氢信号传导中起主要作用，提高SOD和APX酶活性，而且通过转录激活纤维素生物合成途径，增强植物纤维素生物合成，提高植物在盐胁迫下产生生物量[36]。

2.4信号传导与表达调控相关基因

植物在应对非生物胁迫中只要是由信号转导起主要作用，而转录因子参与信号转导， ERF(Ethylene-responsive factor)、DREB(Dehydration responsive element binding protein)等转录因子在盐胁迫过程中诱导表达，提高植物的耐盐性[37-38]。Yang等分离并鉴定了与ERF家族相关的JcERF1基因，将该基因导入到烟草中，转基因烟草比野生型烟草更耐盐[39]。Li等克隆了番茄ERF基因SlERF84，并对其进行了功能鉴定，表明SlERF84作为一种应激反应转录因子，在非生物和生物胁迫耐受性的差异调控中发挥着重要作用[40]。Long等对盐胁迫下的棉花叶片的转录组进行分析，表明在盐胁迫下棉花差异表达基因2356个，其中9.4%为转录因子，在转录因子(222个)中39个属于乙烯反应因子(ERF)家族，其中GhERF4L和GhERF54L在盐处理12 h后表达增加12～15倍，对GhERF4L和GhERF54L进行沉默，棉花幼苗的耐盐性显著降低，表明其在调节棉花对盐胁迫的反应中起着重要作用[41]。

DREB转录因子在植物逆境反应中起着重要作用，已在多种植物中得到鉴定，对DREB的研究主要集中在A-1(DREB1)和A-2(DREB2)两个基团上。Li等对沙漠苔藓的A-5c型DREB基因ScDREB10的耐逆功能进行了表征和分析，ScDREB10的过表达显著提高了渗透胁迫和盐胁迫下拟南芥种子的发芽率，提高了拟南芥苗期的耐盐和渗透胁迫能力，与下游胁迫相关基因的表达和活性氧清除能力的提高有关[42]。Liang等研究发现一个新的a-5型DREB基因ScDREB8，该基因通过上调下游胁迫相关基因的表达和提高ROS清除能力，显著提高了盐胁迫下拟南芥的发芽率，提高了拟南芥幼苗期的耐盐性[43]。Sharma等研究发现MdDREB76基因编码是一种功能性转录因子蛋白，通过诱导抗氧化酶(如超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化氢酶)基因的表达，来增强品种的耐盐性[44]。

乙烯信号转导(Ethylene signal transduction，NAC)参与盐胁迫反应的调控。An等研究发现“MdNAC047 - MdERF3-乙烯-盐耐受”调控途径，转录因子MdNAC047在盐胁迫下具有明显的诱导作用，MdNAC047直接与MdERF3启动子结合并激活其转录调节乙烯的产生，其高表达增强了对盐胁迫的耐受性[45]。Lu等研究表明 PeNAC034和PeNAC045分为ATAF亚组，PeNAC036分为ANAC072亚组，在盐胁迫过程中PeNAC036在整个植株中被强烈诱导，而PeNAC034在根和茎中被显著抑制，PeNAC045在根中被抑制，PeNAC045的过表达导致植株的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率显著降低，适应高盐环境[46]。Xu等在普通小麦中鉴定了一个NAC基因TaNAC29，与盐胁迫、干旱胁迫和ABA胁迫有关，TaNAC29的过表达，植株叶片绿度增加、过氧化氢积累减少、细胞膜稳定性增强、SOD、POD、CAT和APX活性提高，对盐胁迫的耐受性增强，说明TANAC29通过降低H2O2积累和膜损伤，通过增强抗氧化系统，参与调节非生物胁迫应答信号通路来赋予盐胁迫耐受性[47]。

WRKY转录因子在植物发育、防御调节和胁迫响应等多种生物过程中都发挥着调节作用。Cai等研究发现玉米WRKY基因ZmWRKY17能特异性结合W-box，并能激活植物体内的W-box依赖性转录，在NaCl胁迫下，转基因植株积累的ABA含量高于野生型植株，但NaCl处理后转基因幼苗中的一些胁迫相关基因表达水平低于野生型，说明ZmWRKY17可能是通过ABA信号参与盐胁迫反应的负调节因子[48]。Shi等研究发现GmWRKY12全长714bp，编码237个氨基酸，归为WRKYⅡ，可能参与脱落酸(ABA)、干旱和盐胁迫反应，GmWRKY12的过表达增强了转基因幼苗的耐盐性[49]。Liang等在从菊花中分离到一个新的WRKY转录因子DgWRKY5，DgWRKY5包含WKYGQK的两个WRKY结构域，在盐胁迫下，转基因菊花SOD、POD和CAT酶活性显著高于WT，而转基因菊花中H2O2、O2-和MDA的积累减少；在盐胁迫下，转基因菊花的根长、鲜重、叶绿素含量和叶气交换参数均明显优于野生菊花[50]。此外，DgWRKY5转基因菊花中DgAPX、DgCAT、DgNCED3A、DgNCED3B、DgCuZnSOD、DgP5CS、DgCSD1和DgCSD2等逆境相关基因的表达较野生菊花中的表达上调。Bao等研究发现WRKY转录因子中负调控基因PcWRKY33，通过降低应激相关基因的表达和提高细胞活性氧的水平，而降低植株的盐耐性。

3耐盐相关基因在棉花育种中的应用

目前在植物抗逆(旱，盐) 生物学研究方面，仍主要集中在拟南芥、烟草和番茄等模式植物。棉花中耐逆相关基因克隆及功能分析工作在最近几年才刚开始。通过对棉花脱水蛋白基因进行了全基因组鉴定和功能鉴定，发现GhA05G1554(GhDHN03)和GhD05G1729(GhDHN04)高度上调，两个基因的敲除，显著降低了棉花对渗透胁迫和盐胁迫的耐受能力[50]。Magwanga等在陆地棉中分离出了基因Gh-A05G2067(GT-2)，GT-2过表达对棉花具有较强的耐盐性[51]。Yu等将AtEDT1/HDG11转入到棉花中，与野生型相比，盐胁迫后转基因棉花叶片脯氨酸含量、可溶性糖含量和活性氧清除酶活性显著增加；转基因棉叶片气孔密度显著降低，气孔和叶表皮细胞大小显著增大[52]。Liang等研究表明GhABF2的过表达显著提高了拟南芥和棉花的抗旱性和耐盐性，且GhABF2的沉默使转基因棉花对PEG渗透胁迫和盐胁迫敏感，与野生型相比，GHABF2过表达棉花叶片脯氨酸含量、SOD和CAT活性也显著提高，且在干旱和盐碱地条件下，转基因棉花纤维产量增加[53]。Mu等对编码蛋白磷酸酶的GhDsPTP3a进行沉默可以增加棉花的耐盐性，主要是由于盐胁迫诱导ghan8b磷酸化，GhDsPTP3a使ghan8b磷酸化，GhDsPTP3a和ghan8b的表达对植物耐盐性和钙内流有相反的调节作用；在盐胁迫下，GhANN8b的沉默在调节GhSOS1转录水平方面起相反的作用[54]。Kirungu等对基因GhA05G1554(GhDHN03)和GhD05G1729(GhDHN04)进行敲除，显著降低了棉花对渗透胁迫和盐胁迫的耐受能力[55]。

Sun等对713份陆地棉进行全基因组关联研究(GWAS)，发现D09上的两个单核苷酸多态性i46598Gh和i47388Gh同时与两个耐盐相关性状，相对存活率和耐盐水平显著相关[56]。 Dilnur等以215份亚洲棉为材料， 分析发现7号染色体上两个富含SNP的区域同两个与盐度相关性状的相对鲜重、相对茎长显著相关，并开发出了2个候选基因(Cotton_A_37775 、Cotton_A_35901)相关的两个关键单核苷酸 (Ca7_33607751 、 Ca7_77004962)位点[57]。Yuan等采用全基因组关联分析和RNA测序技术，对196个陆地棉种子萌发期耐盐性品质性状基因座和候选基因进行了检测，利用4种环境对棉花耐盐性综合评价，鉴定出33个显著的单核苷酸多态性(SNPs)，在13个QTL中，17个稳定的SNP位于98个候选基因内或附近，其中35个基因被功能性注释为参与盐胁迫反应[58]。张伯阳等研究表明，在盐胁迫过程中棉花GhSEDEG38基因的表达明显上调，构建了该基因的RNAi干涉载体并转化棉花，盐处理后转基因植株的MDA含量和活性氧含量显著高于对照材料，而可溶性糖含量显著低于对照材料[59]。

4展望

综上所述，目前有关盐胁迫基因、转录因子已在烟草、拟南芥等植物中得到验证，但关于棉花的转基因植株耐盐性的提高幅度有限，不能满足大田应用。主要原因在于棉花在盐碱地生长过程中是由多条代谢通路协调的结果，涉及到的基因较为复杂，实验室转基因植株均是单基因的表达，提高植株的耐盐性程度有限；其次是棉花生育期较长，转化效率低。为此应该加强各个研究单位的合作，挖掘耐盐相关的关键基因及关键功能基因的启动子，建立适合棉花的耐盐基因转化体系。同时充分利用大田环境中选择出的优良耐盐棉花品种，开发利用SNP标记和候选基因，挖掘耐盐途径，为棉花耐盐育种奠定基础。