不同氮硫浓度及氮硫比对硫酸盐还原厌氧氨氧化脱氮效果的影响

杨世东，祝彦均，刘 涵，刘泓序

不同氮硫浓度及氮硫比对硫酸盐还原厌氧氨氧化脱氮效果的影响

杨世东，祝彦均，刘 涵，刘泓序

（东北电力大学建筑工程学院，吉林 132012）

该研究在硫酸盐还原厌氧氨氧化（Sulfate-Reducing Anaerobic Ammonium Oxidation，SRAO）脱氮工艺的基础上，探究了SO42-浓度在100 mg/L的条件下，控制NH4+的投加量在不同N/S（NH4+-N/SO42-）浓度比下ASBR（Anaerobic Sequencing Batch Reactor）反应器的运行效果及其脱氮性能。N/S从1.0增大到3.0时，ASBR中氨氮的平均去除率从78.5%增加到94.4%，但体系内SAD（Sulfur Autotrophic Denitrification）菌的丰度及活性未受到明显抑制，SRAO作用和ANAMMOX（Anaerobic Ammonia Oxidation）作用始终是ASBR脱氮的主要途径。当N/S的浓度比由3.0增至4.0时，ASBR中氨氮的平均去除率由94.4%下降为69.2%。这表明随着N/S的增大，体系内ANAMMOX菌和SRAO菌活性的降低，抑制了体系脱氮性能。这时SAD菌的丰度及活性略有增加。硫的去除率随N/S比的变化趋势和总氮的去除规律类似，在N/S=3.0时达到最大74.2%。结合高通量测序结果，说明不同N/S下的脱氮微生物优势菌群会不断变化，改变体系脱氮除硫性能。

发酵；氨氮；菌；硫酸盐还原厌氧氨氧化；硫自养反硝化；

0 引 言

2001年首次发现厌氧氨氧化新工艺，由于包括硫酸盐还原过程，因此称之为硫酸盐还原型厌氧氨氧化过程（Sulfate-Reducing Anaerobic Ammonium Oxidation，SRAO），工艺解释了在厌氧流化床反应器中观察到的氮素和硫酸盐异常损失的现象[1]。硫酸盐还原氨氧化（SRAO）工艺是指厌氧条件下，使硫的最高价态化合物SO42-作为电子受体并将NH4+-N作为电子供体，将氨氮转化为氮气的生化过程，在同一反应单元内可以同步脱氮除硫[2-3]。其中：50%的NH4+-N以凯氏氮（Kjeldahl Total Nitrogen，KTN）的形式在原水中被去除，但在反应脱氮过程中大约存在10%的总氮（Total Nitrogen，TN）以NOx--N形式残留；存在于原水中的S-SO42-，大约有20%的S-SO42-以S-S2-或S-H2S等硫化物的形式残存[1]。因此出水中总氮，总硫酸盐无法彻底去除。但根据试验环境条件不同，残存的S-SO42-和NOx-N所占比例及含量也并不相同。这是由于SRAO过程是一系列的生化联合反应[4]，包括硫自养反硝化过程、厌氧氨氧化过程、硫酸盐还原过程以及其他过程等。

硫的自养反硝化（Sulfur Autotrophic Denitrification，SAD）工艺是以硫的化合物（S2-，HS-）作为反应物在自养条件下进行反应，实现同步去除含氮硫化合物的技术[5]。由于厌氧氨氧化与硫自养反硝化反应具有相似生态位[6]。Schrum等[7]通过研究发现在高基质（高浓度NH4+-N）浓度下，NO2-或NO3-作为SRAO反应产生的中间产物可以有机物作为电子供体进行反硝化作用，实现反硝化与厌氧氨氧化的协同作用。Liu等[8]研究发现在低碳条件下处理含氮硫废水时，SRAO反应产生的副产物（NO3--N和硫化物）可以作为硫自养反硝化（SAD）的底物实现氮素之间转化（NO3--N→N2），促进硫自养反硝化-厌氧氨氧化技术进行。由于厌氧氨氧化（SRAO，ANAMMOX）过程可与硫自养反硝化过程相互作用，并在同一反应单元内同时发生，实现两个脱氮过程联合：自养反硝化过程耦合厌氧氨氧化反应[9]。该过程一方面由于厌氧氨氧化过程及硫自养反硝化过程的同时存在可以提高脱氮性能；另一方面可以促进硫元素在体系内循环，降低水中元素硫对厌氧氨氧化细菌毒害作用及传质效率的影响[10-11]。两者既在同一反应单元，又在同一环境下转化氨氮。因此，合适的底物浓度及比例对于该联合反应是重要的反应前提之一。以往的研究中，N/S浓度比在1.71～13.3之间SRAO反应都会发生[12]。但是在不同的N/S浓度比条件下，对于总氮及硫酸盐的去除效率是不同的。若想通过SRAO过程进行对含氨氮及硫酸盐废水处理的实际应用，找到最佳的氮硫浓度比对于理论的研究和具体操作至关重要。

本研究以厌氧序批式污泥反应器（Anaerobic Sequencing Batch Reactor，ASBR）为反应装置。通过调节原进水中NH4+-N和SO42-的浓度比（N/S浓度比）来改变这一体系中进水的氨氮和硫酸盐的摩尔比以实现脱氮和硫循环两种现象同时发生。研究N/S浓度比对反应器脱氮性能以及微生物种群特征的影响。

1 材料与方法

1.1 试验装置及试验设计

试验装置为有效容积为2.0 L的柱形反应器。如图 1所示。ASBR反应器以48 h作为一个周期，其中由进水期（单次进水1 h）、反应期（间歇搅拌24 h）、沉淀期（22 h）和排水期（1 h）4个阶段组成。各阶段均由自动程序控制器自主控制运行。体系中，控制进水pH值8.2～8.6，溶解氧（Dissolved Oxygen，DO）<0.5 mg/L，反应器温度采用水浴层控制为30 ℃，为了保证避光和恒温，水浴隔层用黑色保温棉包裹。搅拌器设置转速为60 r/min。

在序批式反应器内加入接种的种子污泥，启动时间为110 d，维持水力停留时间（Hydraulic Retention Time，HRT）为48 h。由于先前在无机条件下多数研究的N/S在2左右[12]，因此选择将本试验的N/S控制在其附近，并逐步通过增加进水NH4+-N浓度使N/S逐渐增加。初始N/S浓度比为1.0∶1.0。随后进水NH4+-N由100 mg/L逐渐增加至450 mg/L，使N/S浓度比分别提高至1.0∶1.0、1.5∶1.0、2.0∶1.0、2.5∶1.0、3.0∶1.0、3.5∶1.0、4.0∶1.0。为了保证数据准确，设置一组运行方式及环境完全相同的ASBR作为对比但无重复试验。每一个周期排出1L上清液，循环排放的上清液作为每一周期的检测试样，然后重新添加合成废水。

本试验选择在培养期N/S浓度比分别在1.0、1.5、2.0、2.5、3.0的共5个污泥测样样本冷冻保存后进行微生物群落结果高通量测序分析，分析在五组不同N/S浓度比条件下SRAO功能菌和硫自养反硝化菌等的相对丰度，通过相对丰度查看群落多样性及功能和内部演化规律，分析结果确定该系统内菌类最佳生长环境。

1.2 接种污泥与进水配方

前期启动反应器的研究中，以人工模拟工业废水作为系统进水；以常规厌氧氨氧化（ANAMMOX）污泥及长春东南污水处理厂厌氧池内活性污泥组成种子污泥。采用上述运行工况经110 d驯化培养后强化ASBR反应器内SRAO作用，使NH4+-N和TN（Total Nitrogen）的去除率稳定在91%和87.1%左右。

本试验进水为人工配水，配水组成[13]为：硫酸盐100 mg/L，KH2PO427 mg/L，CaCl2·2H2O 180 mg/L，MgSO4·7H2O 300 mg/L，NaHCO30.5 g/L。并且由于需要在试验期间调整N/S，氨氮的浓度范围选择在100～450 mg/L之间。并且，为了保持系统内异养菌如硫酸盐还原菌活性且真实工艺中废水含有一定量的COD。但应不抑制系统内其他功能自养菌，因此加入葡萄糖浓度为230～250 mg/L。

1.3 测定指标和方法

1.3.1 分析方法

根据Deng等[14]报道的方法计算SRAO脱氮贡献比（SRAO）、ANAMMOX脱氮贡献比（ANAMMOX）和SAD脱氮贡献比（SAD）。总氮测样方法采用碱性过硫酸钾氧化紫外分光光度法，SO42-测定采用铬酸钡比色法[15]，NH4+-N采用纳氏试剂法，NO2--N，NO3--N都采用标准测量方法紫外分光光度法。pH的测定设备使用上海雷磁pH计，溶解氧测定仪器采用溶解氧仪（HQ3OD，HACH，Colorado，USA）测定。数据绘图和统计分析均使用Origin 8.5进行处理。

1.3.2 宏基因组微生物分类测序方法

利用移动互联网技术，实现交通出行的一体化服务及交通出行信息的实时服务，并提供出行点到点的精准信息服务.

本试验使用高通量测序技术利用电脑芯片进行序列检测，效率高并且实用简单，可以在数百万个点上进行阅读测序把平行处理思想用到极致[16]。由于该技术通量高，范围广，单位数据成本低，测序深度高而且结果准确度高等优点，被广泛应用于研究微生物功能预测，群落组成和进行相对丰度计算。

1.3.3 功能菌群定量分析

采用SPSSAU平台对测样结果得出的数据进行统计并计算分析；利用线性回归模型逐步解析氮的元素循环及转化速率与相关脱氮功能菌群的定量响应关系。

2 结果与分析

2.1 不同N/S比下的脱氮除硫率

为了探究N/S对硫酸盐还原厌氧氨氧化（SRAO）工艺影响，进行了210 d的连续性试验。由于每一个周期内都包含4个相同的阶段，为了探究氨氮及硫酸盐等在各个过程的转化效果，选择一个典型周期作为特征周期来观察各物质的变化过程。

在长期的ASBR反应器运行过程中，根据出水总氮含量及出水氨氮含量能够分析出硝酸盐以及亚硝酸盐的积累量极少，因此假设氨氮和硫酸盐仅可通过厌氧氨氧化（SRAO、ANAMMOX）去除，在不同的氨氮和硫酸盐浓度比条件下算出氨氮硫酸盐的去除效率和进行2种反应所对应的脱氮贡献率然后进行分析。

如图2所示为一个典型SBR周期各物质及环境条件的变化。在氨氮去除率最佳的N/S=3.0条件下，氨氮以及硫酸盐主要在间歇搅拌的反应期去除。

如图3所示，N/S浓度比为1.0时，在低氨氮浓度下驯化培养硫酸盐还原厌氧氨氧化污泥。在此阶段末期，氨氮去除效率（Ammonia Removal Efficiency，ARE）稳定至78.5%，硫酸盐去除效率（Sulfate Removal Efficiency，SRE）稳定至53.9%。此时氨氮去除量和硫酸盐去除量之比（ΔNH4+-N∶ΔSO42-）约为1.88，并且此时总氮的去除基本全部是由SRAO过程完成，其脱氮贡献率（SRAO≈100%）。

如图3所示，在N/S浓度比由1.5增加至3.0时，氨氮去除效率（Ammonia Removal Efficiency，ARE）逐渐从约84.4%提高至约94.4%。硫酸盐去除效率（Sulfate Removal Efficiency，SRE）从约57.2%提高至约74.2%，并且在这一阶段，SRAO过程的脱氮贡献率由SRAO≈87.7%降至SRAO≈48.8%。此时总氮去除量由厌氧氨氧化（SRAO、ANAMMOX）过程完成（SRAO+ANAMMOX≈100%），且ANAMMOX过程逐渐增强。氨氮去除量和硫酸盐去除量之比（ΔNH4+-N：ΔSO42-）由2.36提高至4.43。

因此，在N/S为3.0时，反应体系的脱氮效果达到最佳状态。但由于NOx--N的积累，会降低体系内总氮的去除效率，而在这一体系内去除NOx--N是硫自养反硝化的主要过程。硫自养反硝化耦合厌氧氨氧化过程能有效提高TN的去除效率。研究发现构建的硫自养反硝化耦合厌氧氨氧化系统可以使TN去除效率达到95%左右[17]。

2.2 微生物群落结构

采用高通量测序技术研究不同N/S浓度条件下微生物相对丰度变化，如图4所示。

通过高通量测序确定反应体系内微生物菌群分类。其中：与[18]为常规厌氧氨氧化（ANAMMOX）菌的两个科属，在体系内所占比例最高；[19]作为一类硫酸盐还原厌氧氨氧化（SRAO）菌属，可以参与硫酸盐还原厌氧氨氧化（SRAO）反应；[20]为硫自养反硝化（SAD）菌属，在反应体系内进行硫自养反硝化过程。因此体系内存在上述菌种参与反应脱氮过程。

当N/S浓度比提高至2.0时，反应器中微生物群落的相对丰度发生改变。由最开始的8.6%提高10.6%，由15%提高至17.4%，并未发生明显变化；由17.0%提高到了17.9%。

当N/S浓度比提高至3.0时，反应器中提高至13.9%，由提高至20.7%，、并未发生明显变化。从微生物群落结构的相对丰度可以看出，在N/S≤3.0时，反应体系内的优势菌群发生改变。常规亚硝酸盐型厌氧氨氧化菌（，）逐渐成为优势菌群；硫酸盐还原厌氧氨氧化菌（），硫自养反硝化（）、硝化菌和异养反硝化菌的含量大体保持不变。

当N/S浓度比提高至4.0时，反应器中降低至8.5%，降低至16.5%；降低至16.9%；并未发生明显变化。因此在3.0≤N/S≤4.0时，反应体系内的厌氧氨氧化菌群活性受到抑制。体系内常规亚硝酸盐型厌氧氨氧化菌（，）、硫酸盐还原厌氧氨氧化菌（）的相对丰度降低；硫自养反硝化（）、硝化菌和异养反硝化菌的含量大体保持不变。

因此，提高进水N/S浓度比，仅影响厌氧氨氧化菌（ANAMMOX、SRAO）活性。但体系内积累的NOx--N量不同会造成SAD过程的处理负荷不同。如图3、4所示，在N/S=3.0时，体系内厌氧氨氧化菌脱氮效能最佳；此后逐渐提高进水NH4+-N浓度，抑制厌氧氨氧化菌（ANAMMOX、SRAO）活性，总氮去除率由95.5%降低至71.4%。分析原因：

1）硫酸盐参与厌氧氨氧化过程生成单质硫S。一方面污泥在搅拌器搅拌的作用下吸附在单质硫S的表面促进形成颗粒污泥，提高脱氮性能[21-22]。另一方面单质硫S在搅拌器搅拌的作用下吸附在污泥颗粒表面也会影响传质效率，抑制污泥的脱氮效率。

2）硫酸盐改变氮素之间的转化，通过厌氧氨氧化反应将NH4+-N直接转化成N2。NH4+-N：一部分作为ANAMMOX的底物生成NO3-N；而另一部分参与硫酸盐还原厌氧氨氧化（SRAO）反应直接转化为N2。ANAMMOX和SRAO之间会发生底物竞争。因此提高进水NH4+-N浓度，在底物竞争基质作用下ANAMMOX菌在体系内所占比例得到提高。

2.3 脱氮规律及性能分析

基于上述研究成果，计算SO42-浓度在100 mg/L附近的条件下，不同N/S比条件下TN的转化速率与不同功能菌种影响的关系。根据氮素转化途径构建线性回归模型，以研究不同功能菌种对TN转化速率的影响，如式（1）[23]所示（2=0.979，=0.011）。

式中（TN）为TN转化速率，mg/(L·h)；为常规厌氧氨氧（ANAMMOX）；为硫酸盐还原厌氧氨氧化（SRAO）；SA为硫自养反硝化（SAD）。

如式（1）所示，在N/S浓度比的影响下，体系内TN的转化速率[(TN)]主要受[SA/(SA+)]和（/）两个变量影响。反应器中硫，酸盐还原厌氧氨氧化（SRAO）菌在体系内所占比例保持相对稳定。逐步提高进水N/S浓度比，上述2个变量与TN的转化速率正相关。

在不同N/S浓度条件下，TN转化速率主要依赖于SRAO，ANAMMOX和SAD之间的相互协同作用[24]。其中，SRAO和ANAMMOX主要去除体系内NH4+-N，SAD和ANAMMOX主要可以实现将NO2--N和NO3--N转化为N2[25]，而NOx--N的来源生依赖硫酸盐还原厌氧氨氧化（SRAO）和常规厌氧氨氧化（ANAMMOX）过程将作为底物的NH4+-N部分转化[26]。SAD（转化NOx--N）和SRAO、ANAMMOX（转化NH4+-N）两者可以相互协同共同实现体系高效脱氮。

/随着N/S的增加，表明体系内常规厌氧氨氧化（ANAMMOX）菌含量增加有利于提高NH4+-N的去除效果。SA/(SA+)表明体系内NO2--N和NO3--N转化过程。体系内NH4+-N浓度的提高，增加副产物（S和NO2--N）含量可以增强硫自养反硝化（SAD）菌活性[27]。通过调节进水N/S浓度比，可以控制作为副产物NO2-或NO3-的产量促进SAD过程[28]。

当N/S≤1.5时，过量SO42-还原生成单质（S）并将NH4+-N氧化为NO2--N，提高SO42-的转化率和NO2-的产率[29]。此时系统中主要由ANAMMOX和SRAO作为功能菌种。逐渐提高N/S浓度比>1.5时，在硫酸盐还原厌氧氨氧化（SRAO）作用下过量的NH4+-N为反应体系提供充足的电子，将NH4+-N氧化为NO2-N；同时产生的NO2--N可作为常规厌氧氨氧化（ANAMMOX）和硫自养反硝化（SAD）反应的底物，实现厌氧氨氧化-硫自养反硝化技术使体系实现高效脱氮现象[10]。此时系统中主要由ANAMMOX和SAD作为功能菌种。

综上所述，在不同的N/S浓度比水平下会不同程度影响ASBR中ANAMMOX菌，SRAO菌和SAD菌群丰度及活性。改变N/S浓度比会使该体系内脱氮微生物优势菌群不断变化，进而导致脱氮性能的改变。作为脱氮的主要功能菌种，上述3种功能微生物在各系统中对底物的竞争优势存在较大差异，进而改变中间产物的生成量，造成体系内主反应的变化及不同的氨氮及硫酸盐的转化率。

3 结 论

1）当SO42-浓度在100 mg/L附近的条件下通过控制氨氮浓度逐步提高进水NH4+-N和SO42-浓度比（N/S浓度比），在N/S浓度比在3.0时，反应体系脱氮性能处于最佳状态。

2）当SO42-浓度在100 mg/L附近时，不同的N/S浓度比下体系内脱氮的主要过程和途径也不同。当N/S浓度比≤1.5时，SRAO作用主要作为反应脱氮主要途径。在N/S浓度比>1.5时，可以提高ANAMMOX 菌群丰度，实现厌氧氨氧化（SRAO、ANAMMOX）作为反应脱氮主要途径。

3）由于不同N/S下ΔNH4+-N：ΔSO42-的损失比例在不同底物浓度下并不同，所以SRAO耦合SAD体系是一系列的生化偶联反应且占比不同，所以进水N/S仍是这一体系影响脱氮的重要因素。

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Effects of N/S and ammonia concentrations on the process of sulfate reduction anaerobic ammonium oxidation

Yang Shidong, Zhu Yanjun, Liu Han, Liu Hongxu

(,,132012,)

Sulfate-reducing anaerobic ammonia oxidation (SRAO) reaction can be used to remove nitrogen and sulfate simultaneously in the same process, providing a new approach for complex industrial wastewater treatment in wastewater with a high concentration of ammonia and sulfate. However, the unstable SRAO depends easily on various external environmental factors. Particularly the main substrate, the concentrations and their ratios of ammonia nitrogen and sulfate are of great importance to the SARO process. In this study, a systematic investigation was made on the effect of the S/N (NH4+-N/SO42-) ratio at different concentrations on the removal of nitrogen and sulfur in an anaerobic sequencing batch reactor (ASBR). Two ASBRs with a volume of 2.0 L were also used in parallel in the experiment, where the hydraulic retention time was 48 h. The ASBRs were wrapped up with the cotton layer and black paper to isolate from the environment, while remaining at 30 ℃ with the hot water from the water-bath with the casing layer of reactors. The four stages of reactors included loading, mixing, precipitation and drainage, which were controlled by automatic program controllers. The ratio of nitrogen to sulfur was adjusted by adding different concentrations of ammonium chloride and sulfate. The results showed that when N/S increased from 1.0 to 3.0 under the condition of sulfate concentration of about 100 mg/L, the NH4+removal increased from 84.4% to 94.4%. The high-throughput sequence analysis showed that relative abundance ofin the anaerobic reactor increased from 8.6% to 10.6%, and the relative abundance ofincreased from 15% to 17.4%. At this time, the relative abundance and activity of Sulfur Autotrophic Denitrification (SAD) bacteria in ASBR did not change significantly, but the relative abundance of sulfate-reducing ammonia oxidation functional bacteriaandincreased significantly to 13.9% and 20.7%, respectively. The sulfate reduction ammonia oxidation (SRAO) and ANAMMOX were considered to be the main ways of nitrogen removal. An obvious decrease of NH4+removal from 94.4% to 69.2% when the S/N increased from 3.0 to 4.0, which showed inhibition of SRAO and ANAMMOX bacteria in higher S/Ns over 3.0. At the same time, the content of(Sulfur autotrophic denitrifying bacteria) and nitrifying bacteria remained unchanged. The relative abundance ofanddecreased to 8.5% and 16.5%, respectively. Combined with the experimental results, the removal of sulfate according different S/Ns showed a similar trend as TN removal. The TN and sulfur removal rate could reach 94.4% and 74.2% when the N/S value was 3.0. High-throughput sequencing analysis showed the different dominant species of bacteria at the S/Ns, indicating the variation of TN and sulfur removal rate in the ASBR. The sulfate removal at different N/S ratios demonstrated combined denitrification in the system, including SRAO, SAD, and traditional ANAMMOX. The SARO was the dominant process of denitrification, when N/S<1.5, whereas, the effect of ANAMMOX was the main denitrificaiton, when N/S>1.5. An optimum N/S of 3.0 can be expected to effectively couple the SARO and ANAMMOX for the greatest nitrogen removal.

fermentation; ammonia; bacteria; sulfate reducing ammonium oxidation; sulfur autotrophic denitrification (SAD);

杨世东，祝彦均，刘涵，等. 不同氮硫浓度及氮硫比对硫酸盐还原厌氧氨氧化脱氮效果的影响[J]. 农业工程学报，2021，37(16)：199-204.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.16.025 http://www.tcsae.org

Yang Shidong, Zhu Yanjun, Liu Han, et al. Effects of N/S and ammonia concentrations on the process of sulfate reduction anaerobic ammonium oxidation[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(16): 199-204. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.16.025 http://www.tcsae.org

2021-03-24

2021-07-14

吉林省科技厅自然科学基金项目（20150101090JC）

杨世东，副教授，博士，研究方向为污废水处理。Email：15981105115@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.16.025

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1002-6819(2021)-16-0199-06