细菌群体感应及其抑制剂的研究进展

2021-11-26 08:02闪杨莹莹马陇豫孙梦瑶刘超群
河南大学学报(医学版) 2021年4期
关键词:生物膜单胞菌抑制剂

冯 闪杨莹莹马陇豫孙梦瑶刘超群

河南大学 药学院,河南 开封475004

近几十年中,细菌感染性疾病作为世界上最大的健康问题之一,引起了广泛的关注。当前,用于细菌感染的最广泛接受的治疗方法是抗生素。但是,过量使用抗生素会增加细菌的抵抗力,降低治疗效果,并导致高死亡率。在自然界中,细菌倾向于不可逆地附着在基质上,并生活在称为生物膜的多细胞群落中,超过80%的细菌感染与生物膜有关。生物膜是由细胞外基质包裹、高度组织化表面吸附类细菌群体,包被有生物膜的细菌对传统抗生素产生耐药性,从而引发多种慢性和难治性感染疾病,例如耳部感染、细菌性心内膜炎、烧伤感染等。所以,消除生物膜的困难在各个领域中造成了重大问题,包括持续性感染、生物医学植入物和设备、工业环境、海洋设备和食品包装等领域。

细菌群体感应(Quorum sensing,QS)可以调控多种细菌的生理现象,例如生物膜的形成、毒素的产生、荧光的产生等。首次提出群体感应是在20 世纪60 年代末和70 年代初,当时研究人员发现肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的遗传能力和两种海洋细菌的发光能力需要细胞外分子的产生[1⁃2]。然后,通过这些分子的细胞信号被认为是化学交流的一种形式,但是这些早期发表的作品受到质疑,通常被忽略。后来,对费氏弧菌发光机理的研究发现其光密度与细菌浓度呈比例相关性[3]。自20 世纪90 年代以来,群体感应研究的数量不断增加,研究领域也显著多样化,通过对多种不同细菌进行分析,发现在这些细菌中都存在信息交流现象。1994 年,Fuqua 等[4]提出群体感应,分析绿脓杆菌、费氏弧菌及哈维氏弧菌产生的信号分子、生物功能。研究发现,群体感应具有诱导生物膜的形成、调控生物发光、激活毒力途径等多种功能。破坏群体感应途径的化学物质被称为群体感应抑制剂(Quorum Sensing Inhibitors,QSIs),目前已经对群体感应抑制剂进行了广泛的研究,其既不会影响细菌的生长,也可以抑制生物膜的形成和成熟,并且作为抗生素的促进剂,降低毒力因子的含量减弱微生物的毒性,成为新型抗毒药物靶点和抗菌策略的代替方法。

本文在前人的基础上,首先对群体感应的概念和分类进行简单介绍,并且系统性总结群体感应抑制剂的机制、分类和主要应用,可提供新型广泛应用的安全药物替代品的开发策略。

1 群体感应系统

群体感应是一种细胞间的通信途径,使细菌群体根据细胞密度协调重新编程基因表达。简单地说,在所有的群体感应系统中,都产生一个称为自诱导物质(Auto⁃inducer,AI)的信号分子,并分泌(或自由扩散)到周围环境中。随着细菌数量的增长,信号分子的浓度也在增加,直到达到一个阈值浓度,在这个浓度上,它与一个同源受体蛋白结合并激活之。通过群体感应感受器感知到的群体感应信号分子在群体中的所有成员中触发了生理反应,例如毒素、抗生素和荧光的产生,包括形成适应环境变化的生物膜[5⁃6]等,最终在整个群体中重新编程基因表达。

每种菌体群体感应都有不同的信号分子来调节基因表达。根据群体感应信号的不同分子,群体感应分为以下几种类型[7]:①以酰基高丝氨酸内酯类分子(Acyl⁃homoserine lactones,AHLs)作为AI 的革兰氏阴性菌的群体感应系统;②以寡肽类分子(Au⁃toinducing peptide,AIP)作为AI 的革兰氏阳性菌的群体感应系统;③以呋喃酰硼酸二酯类分子(AI⁃2)作为种间细菌交流AI 的群体感应系统,其在多数革兰氏阴性菌和阳性菌中都存在;④以应激激素肾上腺素和去甲肾上腺素AI⁃3 作为种间细菌交流AI 的群体感应系统;⑤其他类型的群体感应系统。下面就按照上述不同类型分别进行介绍。

1.1 以AHLs 作为AI 的革兰氏阴性细菌的群体感应系统

作为群体感应的自诱导剂,AHLs 是一种特殊的小分子水溶性化合物,在革兰氏阴性菌的群体感应中起关键作用,并且是由革兰氏阴性菌产生的信号分子。LuxI 是一种细胞内蛋白酶,可以催化AI 的合成。LuxI 蛋白酶催化载体蛋白的酰基侧链与酰基和S⁃腺苷甲硫氨酸上的高丝氨酸结合形成AHLs[8],AHLs 可以自由进入和离开细胞。当细菌密度增加时,AHLs 积累到一定浓度阈值时,它们结合到LuxR 蛋白的氨基残基上,成为细胞质中的受体,从而激活调控的基因表达[9]。例如,铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)具有两个群体感应系统LasR/LasI 体系和RhlR/RhlI 体系,分别调节信号分子3⁃oxo⁃C12⁃HSL 和C4⁃HSL 的合成,化学信号层次化排列,RhlR 由LasR 调节。前者LasR/LasI 系统中的AHLs 信号分子可与LasR 结合以激活转录,增加了外毒素A、碱性蛋白酶和弹性蛋白酶的基因表达;后者RhlR/RhlI 体系中的AHLs 信号分子可以与RhlR 受体结合,以调节大量基因的表达,如鼠李糖脂溶素、氰化物、壳多糖酶和绿脓素等物质[10]。

1.2 以AIP 作为AI 的革兰氏阳性菌的群体感应系统

在革兰氏阳性菌中,许多线性和翻译后修饰的肽基群体感应信号分子与DNA 摄取和加工、偶联和毒力相关。AIP 通过典型的核糖体合成表达为无活性的前肽,随后经过处理和修饰产生活性群体感应信号,其随着细菌浓度的增加,当到达一定浓度阈值的时候,位于细胞膜上的AIP 信号识别系统与之相互作用,最终发挥调节作用[11]。因为AIP 不能在细胞膜间自由扩散,受体细胞对AIP 的感知通常是由传感器激酶介导的,它通过磷酸化级联将信号从细胞膜转移到细胞内的同源反应调节因子[12]。例如金黄色葡萄球菌(Staphylo⁃coccus aureus)中的短肽分子Agr,不能进入微生物细胞,而是通过与膜受体结合启动信号传输,磷酸化的AgrA 与转录因子SarA 相关,间接激活编码合成毒性因子的基因转录,AgrA 还可以激活靶启动子,上调分泌的毒力因子,下调参与宿主细胞粘附和生物膜形成的表面蛋白[13]。

1.3 以AI⁃2 作为种间细菌交流AI 的群体感应系统

虽然上面描述的AHLs 和AIP 只局限于一个相对狭窄的细菌种类,但有迹象表明一种常见的细菌信号分子。AI⁃2 种间交流群体感应系统,与AHLs首次在发光的海洋生物哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)中被识别。在AI⁃2 介导的种间交流群体感应中,细菌可以通过AI⁃2 感知周围细菌的存在,并调节自身行为[14⁃15]。AI⁃2 是可扩散的信号分子,一种呋喃氧基硼酸二酯分子,由于在其结构中存在硼而独特,通过复杂的磷接力级联激活哈维弧菌的生物发光,中间产生LuxLM 合成的AI⁃1(AHLs 类)和由LuxS 合成AI⁃2[13],当AI⁃2 达到一定浓度时,它进入细胞并在磷酸激酶LsrK 的作用下被磷酸化,形成信号分子,以调节群体感应相关基因的表达[8]。所以AI⁃2已被证明在许多不同的革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、螺杆菌、卟啉单胞菌)和革兰氏阳性菌(如酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌)中,暗示着可能有一个普遍的细菌群体感应的信号分子。

1.4 以AI⁃3 作为种间细菌交流AI 的群体感应系统

以AI⁃3 作为种间细菌交流AI 的信号分子来源于人类应激激素肾上腺素和正肾上腺素,其调控过程非常复杂[16]。存在于部分革兰氏阴性菌,如肠道共生菌、出血性大肠杆菌、大肠埃希氏菌和痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)[17]。

1.5 其他类型的群体感应系统

当然还存在一些其他类型的群体感应系统,例如真菌群体感应系统、CAI⁃1 型群体感应系统、DSF调控的群体感应系统和喹诺酮类群体感应系统(信号分子PQS 和HHQ)[10]。Hornby 等[18]鉴定了调节白色念珠菌形态转变的关键AI 信号分子是金合欢醇。从霍乱弧菌和哈维弧菌发现信号分子CAI⁃1。野油菜黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris)可产生一种称作DSF 的信号分子[19],可以参与多种毒力因子、生物膜形成,细胞外多糖,铁吸收,细胞外酶产生的调节[10⁃20]。铜绿假单胞菌也存在一种新的分子喹诺酮信号,提供了RhlR 和LasR 之间的连接,所以喹诺酮类群体感应系统是铜绿假单胞菌所特有的信号系统[10]。

2 群体感应抑制剂

2.1 群体感应抑制剂的机制

影响AI 及其受体蛋白积累或识别的过程会破坏群体感应,因此群体感应抑制剂的作用机理主要分为以下四种类型:①降解信号分子,使其不能与受体蛋白结合,例如枯草芽孢杆菌所产生的AiiA 酶;②抑制AI 的生成,例如三氯生、邻苯三酚、硼酸和砜类化合物;③合成一些AI 的结构类似物,与相应的受体蛋白竞争性结合,例如海洋红藻、呋喃酮⁃56、呋喃酮C⁃3O;④降低AHLs 同源受体蛋白或AHLs 合成酶的活性,例如AHL⁃酰基转移酶、AHL⁃内酯酶、AHL⁃氧化还原酶。

2.2 群体感应抑制剂的分类

根据其来源,分为两种:天然产物群体感应抑制剂和人工化学合成群体感应抑制剂[21]。下面分别举例进行简单介绍。

2.2.1 天然产物群体感应抑制剂

群体感应抑制剂是由多种生物产生,例如来自陆地、海洋或淡水生态系统的植物、微生物、动物和真菌等。

1)植物类群体感应抑制剂。目前,文献报道许多植物可以产生抑制群体感应的活性物质,例如淡水和海洋微藻还有衍生自海洋红藻(Delisea pul⁃chra)的卤代呋喃酮类化合物,可以抑制哈氏弧菌的生物荧光的产生[22]。当然具有抑制群体感应活性的天然产物还包括从假单胞菌中分离提取出来的姜黄素(curcumin)、儿茶素、肉桂醛、原氨茶素。Thim⁃maraju 等[23]研究证明,姜黄素可以抑制铜绿假单胞菌中毒力因子的基因表达,并影响生物膜的成熟、细菌群游和胞外多糖的产生,同时还可以增强病原菌对抗生素的耐受性[24],被认为是一种新型抗毒药物靶点。哈维氏弧菌BB120 和大肠杆菌O157:H7 菌株的生物膜可以分别被槲皮素和柚皮素抑制[25]。食物大蒜提取物是含AHLs 依赖性群体感应抑制剂。针对铜绿假单胞菌感染的囊性纤维化患者的临床实验发现,口服大蒜提取物有改善的趋势,阿焦烯就是从大蒜中提取出来的抑制剂,可在小鼠肺部感染模型中促进铜绿假单胞菌的清除并增强妥布霉素存在时对生物膜的杀伤能力,有效抑制鼠李糖脂等毒力因子的产生[26]。群体感应抑制剂可以从所有类型的植物组织中提取,包括根和根状茎、花、树皮、叶子、茎、种子和果实等。Musthafa 等[27]证明了人参、香蕉、菠萝等水提物也可以抑制细菌的群体感应。植物生物碱角氨酸,一种从发芽大麦中提取的膳食酚类植物化学物质,传统上被用作血管收缩和间接作用肾上腺素能剂。通过对其研究发现可作为一种新型天然群体感应抑制剂,抗生物膜剂,氨基糖苷类抗生素促进剂,以对抗铜绿假单胞菌。

2)微生物类群体感应抑制剂。微生物类群体感应抑制剂主要包括各种群体感应猝灭酶和次级代谢产物[21]。群体感应淬灭酶的三种类型,即AHL⁃酰基转移酶,AHL⁃内酰胺酶和AHL⁃氧化还原酶,可以破坏AHLs,从而使信号分子失活[28]。微生物的次生代谢产物因其不同的代谢方法而各不相同。群体感应抑制剂分子在芽孢杆菌、嗜硫杆菌和假单胞菌等不同属中都有报道,然而只有少数微生物类群体感应抑制剂已被很好地鉴定。例如环(L⁃脯氨酸⁃L⁃苯丙氨酸)、环(L⁃脯氨酸⁃L⁃异亮氨酸)或者环(L⁃脯氨酸⁃L⁃亮氨酸)可以抑制生物荧光的产生[29]。黏质沙雷氏菌(Serratia plymuthica)和耐热荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)会产生不寻常的抑制剂,即挥发性有机化合物VOC,如二甲基二硫化物[10],抑制以AHLs 为基础的群体感应调节。

3)动物类群体感应抑制剂。Yang 等[30]尝试用AiiA 特异性抗血清中和AiiA 酶时,偶然发现抗AiiA血清对3⁃oxo⁃C12⁃HSL 有较强的灭活活性,因为3⁃oxo⁃C12⁃HSL 在细菌毒力基因表达的群体感应调节中发挥重要作用,所以首次发现来自6 种哺乳动物的血清样品可以对一系列AHLs 信号显示出强烈的酶降解活性。研究发现,在已知的产生群体感应抑制剂的动物中,大部分属于海洋生态系统,Junguk等[31]发现火蚁(Solenopsis invicta)能够产生有效的生物群体感应抑制剂,其体内的生物碱可阻断群体感应。最常见的海洋群体感应抑制剂产生者是软珊瑚和海绵(Ircinia felix),但柳珊瑚、硬珊瑚、海洋苔藓虫(Flustra foliacea)和腹水虫也产生群体感应抑制剂。例如海绵中提取的呋喃三萜化合物在革兰氏阴性菌中起抑制生物膜的作用[21]、Peters 等[32]发现海洋苔藓虫产生不同的溴化生物碱,其阻断AHLs调控基因表达的能力在不同的细菌中已被证明。包括生活中的肉类或肉类副产品冷冻鱼、鸡胸、牛肉等提取物[33]、家禽肉类提取物中脂肪酸类化合物也被认为是群体感应抑制剂的意外来源。

4)真菌类群体感应抑制剂。研究发现,子囊菌青霉属产生的群体感应抑制剂,如青霉素或青霉素酸,其中含有呋喃酮核心,可以靶向RhlR 和LasR 蛋白。例如在海洋真菌(Penicillium sp.QF046)代谢物中发现的星形曲霉毒素可以有效抑制紫色杆菌的群体感应[16]。一些担子菌,如食用银耳、黑木耳(Au⁃ricularia auricular)提取物、黄孢或者药用真菌桑黄(Phellinus igniariu)提取物,也可产生群体感应抑制剂[34⁃36]。

2.2.2 人工化学合成群体感应抑制剂

基于药物设计,即信号或信号前体类似物的化学合成,或先前识别的群体感应抑制剂类似物的化学合成,通过这些仿生方法,大量的分子被发现。根据它们的不同结构,人工化学合成的群体感应抑制剂分为呋喃酮类、内酯类和取代的HSL 类等。其中,化学合成的呋喃酮类化合物研究相对广泛,例如He Z 等[37]发现的呋喃酮C⁃30,可以作细菌群体感应信号分子的拮抗剂。Joseph 等[38]研究发现信号分子AHLs(OdDHL)是由Lux 型酶生物合成,而这些AHLs 信号被细胞内的LuxR 型受体感知,它们结合信号后通常形成活性二聚体,作为转录因子诱导群体感应调控基因的表达。Reverchon S 等[39]合成的22 种新型AHLs 类似物,分别在酰基链的C⁃4 位上有衍生物、环烷基或芳基取代基,可以竞争性抑制天然诱导剂活性的能力。Morkunas 等[40]发现铜绿假单胞菌可以产生一系列的毒力因子,增强其破坏宿主组织并导致疾病的能力,其中最重要的毒力因子是花青素。但是通过一种称为群体感应的细胞间通讯机制可以调节花青素的产生,他们合成的非生物OdDHL 模拟物,能够与内源OdDHL 竞争的新化合物,从而抑制花青素的产生。Roy 等[41]开发了AI⁃2 信号分子的C⁃1 烷基类似物,该类似物与AI⁃2一样,被细菌激酶LsrK 激活,并通过转录调节因子LsrR 调节AI⁃2 特异性基因转录,同时抑制多种细菌的群体感应响应。研究发现[42],针对AI⁃2 合成的LuxS 蛋白,会导致信号通路的缺陷,在控制多种病原体方面更为有效。例如卤代呋喃,对AI⁃2 群体感应有直接的抑制作用,增加体外产生AI⁃2 的浓度对生物膜密度有负面影响。

2.2.3 细菌群体感应淬灭酶

群体淬灭是在群体感应需要信号分泌、识别、信号⁃受体复合体形成等任一过程中被干扰而影响甚至阻断群体感应[43]。群体感应调控的基因与细菌致病性、致腐性等性状相关,所以任一过程都需要有序并且高效地完成。研究开发的两种信号分子类似物:环孢菌素A 与伐司朴达都可以通过阻止Rgg2的激活、促 进Rgg3 的 抑制,来干扰生物膜形成[43⁃44]。Persson 等[45]合成了一些小系列的构象限制类似物,其中基于硫化物AHLs 被接枝到一个二硫烷基上,比大蒜衍生的结构更加灵活有效,还可以通过对酰基链的修饰,可以与HSL 竞争受体结合位点,实现群体淬灭。Takaya 等[46]研究发现Lon 蛋白酶是一个强大的负调控因子,通过降解特定的底物来调节细胞系统,其中就包括群体感应系统。

3 群体感应抑制剂的应用

3.1 新型抗菌策略

抑制群体感应是控制细菌生长和致病的有效替代策略。干扰一个菌群的群体感应可以控制致病细菌的过度生长,而不会对细菌遗传造成过大的选择性压力,从而导致耐药突变体的产生。群体感应抑制剂可以通过增加生物膜中的细菌敏感性或者增加感染后的宿主存活率来提高抗生素治疗的成功率[47]。例如Sun 等[48]合成的多种药物传递的氮化碳空心球,通过群体感应抑制剂、抗生素和光动力治疗联合抗菌,然而群体感应抑制剂作为单一治疗在人类治疗上的应用,似乎不如在其上使用抗生素或抗生素加生物膜分散剂的综合治疗策略。V2O5纳米线作为一种催化剂材料,具有类似过氧化物酶的活性,可以催化过氧化氢和卤离子生成次卤酸和单线态氧,其中次卤酸可以卤化信号分子,干扰信号分子的产生破坏群体感应,阻止生物膜的形成[49]。

3.2 植物源生物防治剂

研究表明,植物源的群体感应抑制剂在不抑制细菌生长的情况下能够抑制细菌的群体感应,来降低病原菌的致病性,具有不易诱导细菌耐药性又可以起到防治细菌病害的优点[50]。例如香樟(Cinna⁃momum camphora)制备的精油可抑制大肠杆菌、紫色杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞杆菌的活性,是基于细菌群体感应抑制作用的新型抗菌物质,其制备方法简单可靠,并且抑菌剂具有对细菌不产生耐药性和无毒害作用等优点和特点。因此,以细菌群体感应为靶标的植物源生物防治剂的研发已成为热点。

3.3 水产养殖

随着水产养殖的集约化,生态和动物健康问题出现,其中细菌性疾病是商业水产养殖中最严重的问题之一。弧菌病通过藻类、轮虫和用于饲养的青蒿菌传播,在几乎任何种类的水产养殖生物中都有很高的死亡率。通过具有信号分子降解活性的群体感应抑制剂处理从而增加水产品的产量[51]。20 世纪初Defoirdt 等[52⁃53]证明了天然人工合成的溴化呋喃酮可以通过破坏以AI⁃2 基础的病原菌群体感应来保护卤虾(Artemia franciscana),但其对高等生物可能具有毒性。研究发现从欧洲黑鲈(Dicentrarchus Labrax)和亚洲黑鲈(Lates calcarifer)中可以分离出具有两种不同的AHLs 降解富集培养基(ECs)混合物,由于弧菌的毒力是由AHLs 依赖的群体感应系统介导的,所以这些新型ECs 混合物在水产养殖系统中起群体感应猝灭作用[54]。

3.4 新型食品防腐剂

每年,由于粮食腐败造成的经济损失非常严重。新鲜食物的腐败主要是由微生物活动引起的。因此,开发新的防腐剂和开发防止腐蚀的新方法已成为关注的焦点[55]。由于群体感应在食品腐坏和细菌致病过程中起着至关重要的作用,因此干扰群体感应系统可能是防止食品腐坏和人类感染的有效策略。例如从商业鱼类,綦国红等[55]分离出的三种假单胞菌可产生AHLs,并通过群体感应调节细菌腐败特征的表达。AHLs 的水平与腐败细菌的数量相关[56],在由革兰氏阴性菌变质引起的食物腐败中检测到AHLs,发现当变质细菌达到一定数量时,将检测到AHLs。因此,安全稳定的群体感应抑制剂将为解决食品变质,延长食品保质期,确保食品安全提供新途径。

3.5 污水处理

为了使膜生物反应器(Membrane bioreactor,MBR)的废水处理具有可持续的性能,探索新型的生物群体感应抑制剂来控制膜生物淤积是非常有价值的。在最近的研究中,群体感应抑制剂为控制膜生物污染提供了替代途径。例如甜菜提取物(PBE)作为群体感应抑制剂,可以通过抑制AI 信号分子的生成来减缓膜生物淤积[57],可能成为一种新的靶向AI 控制膜生物污染的药剂。

3.6 其他应用

有研究证实共价结合的群体感应抑制剂二氢吡咯酮(DHPs)对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌均有降低黏附的作用[58],表面固定化抗菌DHPs 在体外48 小时可以减少细菌粘附和生物膜的形成。因此,基于加入群体感应抑制剂的策略是预防设备相关性感染的一种潜在方法。还有文献报道一种新的AHLs 降解蛋白,称为AidH,可以水解AHLs 的高丝氨酸内酯环的酯键,显著降低假单胞菌生物膜的形成和果胶杆菌的致病性,表明该酶能够通过降解AHLs 有效地抑制这些细菌的群体感应依赖功能[59]。所以AHLs 酶促失活的群体猝灭在预防和治疗感染方面有很大的前景。

4 结语

目前,细菌群体感应在遗传学、生物化学、基因调控等方面都有很大的进步。通过对群体感应系统的研究,我们发现多种菌属存在大量的群体感应信号分子和调控功能,扩展了群体感应信号分子的生物学功能,同时也促进了新概念和术语的出现和传播,如群体猝灭、抗病毒作用、扩散感知、质量转移和社会微生物学。

随着多种抗生素耐药菌株的出现,群体感应的抑制提供了一些有趣的可能性来减少耐药出现的选择压力,被认为是一种很有前途的新型抗毒药物靶点。所以,基于群体感应抑制剂的治疗是一种有吸引力的策略来抑制细菌生物膜的形成而不引起过度的抗生素耐药性,很大程度上是由于对植物化学物质和抗生素的替代或补充方法的需要,这种相对新颖的抗菌机制使其在开发新型抗细菌感染药物方面有很大潜力。然而,在抑制群体感应方面,仍然有许多问题有待解决,例如分子或者酶的靶向和传递、评估细胞毒性、群体感应抑制剂在体内体外的不良影响等。尽管有相对丰富的数据和相关的专利,但抑制群体感应策略并没有广泛应用于创新产品,如海洋工业的防污漆。虽然许多生物或组织提取物表现出抑制群体感应活性,但仅在少数情况下才对活性化合物进行了充分表征。因此,未来有必要对相对复杂系统中关键种群体感应及各个群体感应通路间的关系进行研究。

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