水稻苗期高温RNA-SEQ分析

张伟 张亚龙 台德卫 张效忠 汪婉琳

摘要 利用水稻苗期转录组数据，分析在高温处理条件下不同时间段基因表达水平变化，筛选出可能参与高温热害的基因。LOC_Os04g04970、LOC_Os03g15960和LOC_Os03g51459，其在受到热处理1 h的表达水平显著上调，随着热处理的时间延长，其表达水平逐渐降低，可能与热处理相关。该研究可为进一步揭示水稻苗期高温热害分子生物学研究提供参考。

關键词 水稻;苗期;高温胁迫;转录组

中图分类号 S 511  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）20-0120-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.030

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

High Temperature RNA-SEQ Analysis of Rice Seedling

ZHANG Wei ZHANG Ya-long TAI De-wei1 et al （1.Rice Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Science，Hefei，Anhui 230031;2.University of Washington，WA，U.S.A 98195）

Abstract This study used rice seedling transcriptome data to analyze the changes in gene expression levels at different time periods under high temperature treatment conditions， and screened out three genes （LOC_Os04g04970， LOC_Os03g15960 and LOC_Os03g51459） with significant changes in expression levels at each time period. Their expression level was significantly up-regulated after 1 hour of heat treatment， and gradually decreased with the extension of heat treatment， which may be related to heat treatment. This study will provide a reference for further revealing the molecular biology of high temperature heat damage in rice seedlings.

Key words Rice;Seeding stage;Heat stress;RNA-seq

基金项目 安徽省科技重大专项（h202003a06020005）;科技部国际合作司常规性科技援助项目（KY202001010）。

作者简介 张伟（1985—），男，安徽临泉人，助理研究员，博士，从事分子生物学与生物信息学研究。

收稿日期 2020-12-17;修回日期 2021-01-19

近年来，随着环境的变化，高温天气频繁出现，高温正影响我国长江中下游的水稻生产[1]。当日最高温度高于水稻适宜生长温度范围时，会影响水稻的生理生长和生殖生长，造成植物光合作用系统、细胞膜稳定性、激素等方面发生变化，甚至导致植物死亡[2]。高温通过影响植株生理生长和生殖生长，最终表现为产量下降，品质降低[3-4]。

在水稻生殖生长阶段和成熟阶段遇到高温时危害较严重，水稻在整个生长发育过程中对高温敏感的时期首先是抽穗开花期[5-7]，花粉成熟、花药开裂、花粉在柱头上发芽和花粉管伸长等均受到影响，在水稻减数分裂期如遇35 ℃以上高温并持续3 d及以上，会导致水稻花器发育不全，花药开裂率下降，花粉发育不良，花粉育性和活力下降等[8-9]，最终影响结实率。抽穗至成熟阶段高温会加快灌浆速率，缩短灌浆的持续期，籽粒光合产物不足，淀粉及其他有机物积累减少，使籽粒的充实度（千粒重）受到影响，米粒垩白增加，透明度变差[10]。高温不但在孕穗期、开花期、灌浆期等生育时期影响水稻生产，在营养生长时期受到高温时对植株的生长也产生重要影响，如导致植株生长速度下降，叶色变淡等[11]，尤其是在水稻幼苗时期，受到高温胁迫时水稻叶片中蛋白种类和含量变化较大，植株高度、干物质含量性状也会发生变化[12-13]，对水稻植株产生过氧化伤害作用[14]，进而影响水稻植株后期的生长进程。

当前很多研究集中于水稻生殖生长阶段，对生理生长阶段研究较少，水稻苗期是水稻生理生长重要阶段之一，而关于水稻苗期受到高温处理其基因表达方面的研究较少。随

着生物信息学与分子生物学的发展，为水稻基因组、转录组、生理生化等方面的研究提供了技术保障，也为揭示水稻耐高温研究注入新的动力。该研究利用水稻苗期高温处理的RNA-seq数据，使用Hisat2+Deseq2分析表达水平差异显著的基因[15-16]，进而预测和发掘水稻苗期与高温处理相关基因，旨在为水稻高温相关基因进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 数据来源 从 The Rice Annotation  Project （RAP）数据库下载 Os-Nipponbare-Reference- IRGSP-1.0 的水稻基因组序列作为参考基因组和基因组注释文件（http：∥rice.plantbiology.msu.edu/downloads.shtml）。从NCBI（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）利用sratoolkit下载并拆分水稻的 SRA（PRJNA530826）数据。

1.2 试验方法 利用trimmomatic过滤低质量的reads和接头，用fastqc评估数据质量是否可以用于后续分析。利用Hisat2将reads比对到基因组，接着利用stringtie将比对上的reads进行转录组组装，利用stringtie merge进行合并，合并后对组装的转录本进行表达水平的计算。利用prepDE.py将计数转换为Deseq2输入文件。利用Deseq2进行基因差异表达分析，筛选条件（阈值）：绝对log2FC> 并且Padj<0.0 用ggplots作图。每个时段均有差异表达基因，利用Python code将每个时段均差异显著的基因取出，进行表达量计算分析，用pheatmap绘heatmap图。

2 结果与分析

从NCBI数据库下载水稻日本晴14 d苗期茎和叶受到热处理的RNA seq原始数据（表1），处理时间分别为1、3、6、12、24、36和48 h，每个时间段3次重复。去除接头和低质量的reads后获得高质量的reads用于下一步分析。

利用Hisat2软件建立日本晴基因组索引，利用Hisat2分别将reads比对到基因组上，运行stringtie获得含有count的gtf文件，利用prepDE.py转换得到的数据用于下一步统计分析。

Deseq2分析差异表达基因，得到每个处理时段差异表达的基因，表明当受到热处理时，一系列相关基因表达水平发生变化，如图1所示。进一步分析发现，有些基因在所有处理时段均上调或者下调。利用Python code提取这些基因的counts，用于分析这些基因在受到热处理时不同时期的表达水平（图2、3），表明这些基因在受到热处理后，其表达水平显著下调或者上调。其中，LOC_Os04g04970、LOC_Os03g15960和LOC_Os03g51459 3个基因在受到热处理1 h的表达水平显著上调，随着热处理的时间延长，其表达水平逐渐降低，可能与热处理相关。LOC_Os03g15960编码heat shock protein，另外2个功能鲜见报道，仍需要进一步研究。LOC_Os02g35750和LOC_Os03g11910在处理3 h表达水平显著上调，随着处理时间的延长，其表达水平逐渐降低。LOC_Os02g35750可能在叶发育早期与叶绿体生成有关[17]，然而，其表达水平受到热处理影响，是否也参与水稻苗期高温胁迫途径仍需进一步研究。LOC_Os03g11910是Hsp70家族成员，在保护植物免受非生物胁迫方面发挥着重要作用[18]，尚需揭示该基因的生物学功能。图3显示，这些基因经过高温处理后，其表达水平显著下调，需要在进一步的生物学研究过程中揭示它们的生物学功能。

3 讨论

该研究分析表明，在水稻苗期高温胁迫处理条件下，一些基因在各处理时段均上调，其中有些基因在处理1 h表达水平显著上调，随着处理时间的推移，其表达水平逐渐降低，它们与已报道的功能基因功能相符，这进一步证明该研究的可靠性。采用取交集的方式，发掘每个时期均上调或下调基因，在方法上具有创新性，同时增加了发掘基因的可靠性，为苗期耐热基因功能研究提供有价值的参考。该研究所用材料为日本晴，作为水稻参考材料适用于多方面的研究，然而若选用耐热的极端材料进行研究，将能更加充分发掘耐热关键基因，将继续开展这方面的研究。该研究利用多种处理时段的数据挖掘水稻苗期耐热关键基因，为水稻苗期耐热基因功能与机制分析提供基础具有实际意义。

4 结论

该研究分析出3个基因（LOC_Os04g04970、LOC_Os03g15960和LOC_Os03g51459）很可能与水稻苗期受到热胁迫相关。

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