程序进样-柱前衍生-高效液相色谱法测定乳制品中牛磺酸含量

吴海智，肖玥惠子，朱礼，袁列江，王淑霞，黄渊圆

（湖南省产商品质量监督检验研究院，湖南长沙410007）

牛磺酸（taurine）别名牛胆素、牛胆酸，化学式为C2H7NO3S，无臭，微酸，易溶于水[1]。牛磺酸分布于动物组织细胞内，具有保肝利胆、抗心律失常、预防心血管疾病和提高免疫力的生理作用，能够促进婴幼儿脑组织和智力发育[2-4]。我国于1993年批准牛磺酸在乳制品、婴幼儿食品及谷类制品、强化饮料中添加作为功能营养剂使用[5]。目前牛磺酸的测定方法主要有荧光光谱法、薄层色谱法、离子交换紫外分光光度法和高效液相色谱法[6-12]。现行的国家标准方法GB 5009.169—2016《食品安全国家标准食品中牛磺酸的测定》第二法采用丹磺酰氯柱前衍生，衍生过程操作繁琐，耗时很长且稳定性较差，样品在冷藏条件下仅能保存2d[13]。本研究采用程序进样的方式实现对乳制品牛磺酸进行快速测定，利用自动进样器完成衍生，衍生化试剂使用量小，试验操作简单，减少了人工操作产生的误差，适用于乳制品中牛磺酸的测定。

因羊乳中含有丰富的蛋白质、脂肪、矿物质、维生素等，且更利于人体消化吸收，对保护视力和快速恢复体能有很大益处[14]，市售羊乳的价格远高于牛乳。因此需要建立一种简单有效鉴别羊乳真伪的方法，以确保羊乳制品质量和安全[15]。牛磺酸是人和动物必需的一种氨基酸，牛奶中牛磺酸含量较低，使用牛奶喂养婴幼儿相对母乳喂养的婴儿发育较为迟缓，主要原因之一是牛奶中缺乏牛磺酸[16]，而羊乳中含有很多容易被人体消化吸收的游离氨基酸。因此通过对羊乳、牛乳中牛磺酸含量进行测定，来鉴别羊乳的真伪具有可行性。本文利用程序进样-柱前衍生-高效液相色谱法测定检测分析不同品种及地域的乳制品中牛磺酸含量，探索建立以牛磺酸为特征指标的评价方法应用于羊乳的真伪鉴别。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪（包括四元汞、脱气机、自动进样器、柱温箱、化学工作站、荧光检测器）、ZORBAX Eclipse-AAA色谱柱：美国安捷伦公司；Q224-1CN电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Allegra 25R高速离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；KQ－250B超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.1.2 试剂材料

甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、亚铁氰化钾（分析纯）、乙酸锌（分析纯）、无水碳酸钠（分析纯）、硫酸钾（分析纯）、硼酸（分析纯）、磷酸二氢钠（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；邻苯二甲醛（色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛磺酸标准品（纯度≥99.9%）、月桂醇聚氧乙烯醚、2-巯基乙醇（分析纯）：上海安谱实验科技股份有限公司。

全脂羊奶粉、全脂牛奶粉：湖南省产商品质量监督检验研究院提供；纯羊奶、纯牛奶：市售。

1.1.3 试剂的配制

亚铁氰化钾溶液（150 g/L）：称取15.0 g亚铁氰化钾，用去离子水溶解并定容至100 mL；乙酸锌溶液（300 g/L）：称取30.0 g乙酸锌，用去离子水溶解并定容至100 mL；流动相A：称取4.78 g磷酸二氢钠，加入1 000 mL去离子水溶解，用10 mol/L NaOH溶液调至pH 7.8；流动相B：移取500 mL乙腈加入500 mL甲醇，超声混匀；硼酸-碳酸钠缓冲溶液：称取碳酸钠40.7 g，硫酸钾18.8 g，硼酸13.57 g，加去离子水定容至1 L；邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）衍生溶液：称取邻苯二甲醛400 mg，加入甲醇7 mL，2-巯基乙醇1 mL，10%月桂醇聚氧乙烯醚（Brij-35）2 mL，用硼酸-碳酸钠缓冲溶液定容至500 mL。

1.1.4 标准溶液配制

准确称取0.100 0 g牛磺酸标准品，用水溶解并定容至100 mL，配制成1 mg/mL的储备液。吸取储备液10 mL，用水定容至100 mL，配制成100 μg/mL的中间液，再分别吸取一定量的中间液用水稀释成0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL 的标准工作溶液。

1.2 方法

1.2.1 样品的前处理

准确称取固体试样2 g，液体试样10 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加25 mL 40℃左右温水，涡旋混匀溶解后，放入超声波振荡器超声辅助提取10 min。加1.0 mL乙酸锌溶液和1.0 mL亚铁氰化钾溶液，涡旋混合，放入50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，充分混匀。样液于5 000 r/min下离心10 min，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，上机测试。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse-AAA（3.0 mm×150 mm，3.5 μm）；流动相为流动相 A∶流动相 B=85∶15（体积比）；流速：0.5 mL/min；柱温：35℃；检测波长为激发波长：338 nm，发射波长：425 nm；进样量：1 μL。

1.2.3 自动进样器进样程序

吸取（在固定位置）2.0 μL硼酸-碳酸钠缓冲溶液后，吸取（在指定位置）1.0 μL样品，混合等待0.5 min；洗针，再吸取（在固定位置）1.0 μL OPA衍生溶液，洗针，吸取（在固定位置）32 μL去离子水，混合，进样。

1.3 数据处理

使用Agilent 1200高效液相色谱仪配套的色谱处理软件完成数据采集分析，试验数据使用Microsoft ex－cel软件进行整理与分析。

2 结果与分析

2.1 提取试剂的选择

GB 5009.169—2016《食品安全国家标准 食品中牛磺酸的测定》第一法、第二法分别选用偏磷酸溶液（30 g/L）、水作为牛磺酸的提取试剂。本方法鉴于牛磺酸极易溶于水，选择水作为提取试剂，试样中牛磺酸经水超声辅助提取后直接上机测定。

2.2 衍生化试剂的选择

GB 5009.169—2016《食品安全国家标准 食品中牛磺酸的测定》第二法使用丹磺酰氯为衍生化试剂，通过分别使用丹磺酰氯和邻苯二甲醛衍生化试剂对牛磺酸进行柱前衍生，结果为使用丹磺酰氯衍生化试剂进行柱前衍生灵敏度相对邻苯二甲醛要低，色谱峰峰型较差，且其衍生物稳定性较邻苯二甲醛衍生物较差。综合考虑，使用邻苯二甲醛为本方法使用的衍生化试剂。

2.3 衍生方式的选择

GB 5009.169—2016《食品安全国家标准 食品中牛磺酸的测定》第二法使用人工手动衍生的方式，该方法衍生过程比较繁琐，而且耗时2 h以上。且衍生物稳定性较差，样品在冷藏条件下仅能保存2 d，对试验时间控制要求较高。本方法采用程序进样解决了牛磺酸衍生物进样先后顺序会影响测试结果的难题，自动进样器衍生后立即自动进入色谱柱内进行分析，保证了标准品和样品的衍生时间的一致性，且大大提高了工作效率，减少了人员操作而产生的误差。

2.4 仪器色谱条件的选择

本方法采用磷酸盐缓冲液和乙腈甲醇流动相体系对样品中牛磺酸进行洗脱，并对比了ZORBAX E-clipse-AAA与ZORBAX EXTEND-C18柱的分离效果，最终选用ZORBAX Eclipse-AAA色谱柱对牛磺酸进行分离，同时通过调节流动性的配比及流动相的pH值，得到的色谱图见图1～图2。

图1 牛磺酸标准品的色谱图Fig.1 Chromatogram of taurine standard

图2 样品中牛磺酸的色谱图Fig.2 Chromatogram of taurine in sample

由图1～图2可知，本研究选取的色谱条件取得了很好的分离度和峰形。

2.5 进样程序的设定

为消除不同乳制品基质的测定影响，保证方法的通用性和适用性。进样程序中，加入硼酸-碳酸钠缓冲溶液，用以调节测试液的pH值，提高了测定的稳定性，并通过设置多次清洗进样针头程序，最大程度降低了样品间的相互干扰。

2.6 方法学考察

2.6.1 标准曲线及线性方程

按优化的色谱条件，将标准工作溶液依次经高效液相色谱仪测试分析，通过浓度对峰面积的线性拟合得牛磺酸的线性方程及相关系数见表1。

表1 线性方程及相关系数Table 1 The linear equation and correlation coefficient

由表 1 可知，牛磺酸在 0.5 μg/mL～50 μg/mL 浓度范围内具有良好的线性关系，线性相关系数为0.999 9，满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范》“对于确证方法，相关系数不应低于0.99”的要求。

2.6.2 精密度、回收率

在纯牛奶中进行 3 个水平（1.0、10.0、40.0mg/100g），6个平行的加标回收试验，测定后得到牛磺酸的加标回收率和相对标准偏差，结果见表2。

表2 加标回收率试验结果（n=6）Table 2 Results of recovery rate（n=6）

由表2可知，在本试验条件下，3个添加水平下牛磺酸的平均回收率为99.2%～104.0%，相对标准偏差为3.22%～5.25%，方法加标试验结果满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范》要求。

2.6.3 准确度

本方法与GB 5009.169—2016《食品安全国家标准食品中牛磺酸的测定》方法比对结果见表3。

表3 方法比对结果Table 3 The results of method comparison

由表3可知，不同方法的测试结果的相对极差均小于算术平均值的10%，表明本方法具有较高的准确度。

2.6.4 方法检出限、定量限

在10 g纯牛奶样品中加入1 mL牛磺酸标准工作溶液（20 μg/mL），以基线10倍噪声值为定量限在标准曲线查得结果计算，测得方法定量限为0.2 mg/100 g。

2.7 实际样品检测

对6批次的不同品牌全脂牛奶粉、6批次不同品牌全脂羊奶粉、6批次不同品牌纯牛奶、6批次不同品牌纯羊奶的牛磺酸含量进行测定，测定结果分别见表 4、表 5。

表4 奶粉测定结果Table 4 Test results of milk powder

表5 液体奶测定结果Table 5 Test results of liquid milk

由表4可见，全脂牛奶粉牛磺酸的含量范围为2.89 mg/100 g～7.42 mg/100 g，全脂羊奶粉牛磺酸的含量范围为 36.6 mg/100g～60.4 mg/100 g。

由表5可见，纯牛奶牛磺酸的含量范围为0.37 mg/100 g～0.68 mg/100 g。纯羊奶牛磺酸的含量范围为4.20 mg/100g～6.10 mg/100 g。不同产地及品牌的乳制品中牛磺酸均略有差异，主要原因是泌乳动物品种、气候、产奶期以及生产工艺的差异。国产和进口乳制品中牛磺酸并无明显差异。羊乳与牛乳的结果比较见表6。

表6 羊乳与牛乳结果比较Table 6 The results of goat milk and cow milk comparison

从表6的数据可以看出，无论是奶粉样品还是液体奶样品，羊乳的牛磺酸均明显高于牛乳，其比值均≥9，差异显著。

3 结论

本文对乳制品中牛磺酸的检测方法进行了研究，建立了快速高效检测乳制品中牛磺酸含量的程序进样-柱前衍生-高效液相色谱法。试验结果表明，方法加标回收率为99.2%～104.0%，相对标准偏差为3.22%～5.25%，线性相关系数R2=0.999 9，定量限为0.2 mg/100 g。该方法样品前处理简单，试剂消耗少，分析时间短，准确性和精密度好，适用于乳制品中牛磺酸的定性定量检测。本研究通过对全脂牛奶粉、全脂羊奶粉、纯牛奶、纯羊奶中的牛磺酸含量进行了测定。测定结果显示，纯羊奶中牛磺酸的平均含量高达4.91 mg/100 g，全脂羊奶粉中牛磺酸的平均含量高达47.70 mg/100 g，均为牛乳的9倍多，这就为以牛磺酸为特征指标区别牛羊乳提供了参考依据。