龙脷叶中山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量测定与相关性分析

柳小春 叶芳敏 吕伟旗

中药龙脷叶系大戟科守宫木属植物龙脷叶Sauropus spatulifolius Beille 的干燥叶，性平，味甘、淡，归肺、胃经，具有润肺止咳、通便等功效，主要用于肺燥咳嗽、咽痛失音、便秘等症，主要分布于广西、广东、福建、江苏等省[1]。研究表明，龙脷叶含多种化合物，包括皂苷、糖类、生物碱、鞣质、黄酮类、香豆素等[2]，具有止咳、祛痰、抗炎、镇痛、抑菌、保肝、抗过敏等药理活性[3]。目前，龙脷叶现有研究多集中于单体化合物提取分离、药理活性、显微与薄层鉴定与组学研究等，对于多产地含量测定比较研究鲜有报道[4-7]。山奈酚-3-O-龙胆二糖苷为2020 年版《中国药典》规定的质量评价指标性成分，具有抗炎抑菌等活性[8]。药用植物的活性成分受产地、经纬度、海拔等生境影响，表现出较大的差异性，这种原药材活性成分含量上的差异，严重影响中药的临床用药与疗效。本课题拟收集广西、广东、福建、江苏等7 省18 个产地龙脷叶新鲜种质资源，建立HPLC 法对其山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量进行快速测定，并分析其与生长性状、经纬度、海拔等因素间的相关性，以期为龙脷叶资源开发利用与优良品种选育提供依据。

1 实验材料

1.1 药材样品 2020 年9 月—2020 年10 月，采集广东、江苏、上海、广西、云南、海南、福建7 省18 个产地龙脷叶新鲜叶片，经浙江省丽水市人民医院药学部叶芳敏副主任药师鉴定为大戟科守宫木属植物龙脷叶Sauropus spatulifolius 的叶片，见表1。

表1 龙脷叶样品信息

1.2 仪器与试剂 2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；DHG-9053A 台式鼓风干燥箱（无锡玛瑞特科技有限公司）；ST 型-单槽超声波清洗机（广东固特超声仪器有限公司）；FA1004 电子分析天平（上海光学仪器厂）；R-1002LN 旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；山奈酚-3-O-龙胆二糖苷C27H30O16（B50372）购于上海源叶生物科技有限公司，甲醇、乙腈等试剂购于国药集团化学试剂有限公司。

2 方法

2.1 生长性状测定 取龙脷叶新鲜植株，用卷尺测量株高，用游标卡尺测量枝条粗、叶长、叶宽，计算叶长宽比=叶长/叶宽，n=20。

2.2 山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量测定

2.2.1 系统条件 Agilent Extend-C18 色谱柱（4.6×250mm，5μm），流动相乙腈—0.4%磷酸水溶液，体积流速1.0mL/min，检测波长λ=349nm，进样量10μL，柱温30℃，HPLC 色谱图见图1。

图1 HPLC 色谱图（A 为标品图；B 为样品图；1 号峰为山奈酚-3-O-龙胆二糖苷）

2.2.2 线性关系 精密称取山奈酚-3-O-龙胆二糖苷标准品，用甲醇配制成浓度为62.20μg/mL 的标准品溶液，移液管精密吸取标准品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0mL，甲醇定容至10mL 容量瓶，摇匀取适量过0.22μm 滤膜，按照“2.2.1”系统条件下进样，记录峰面积，以标准品浓度为横坐标C，峰面积为纵坐标Y 绘制线性方程，得山奈酚-3-O-龙胆二糖苷线性方程为Y=17359C＋3491.2，线性范围为0.622～12.44μg/mL。

2.2.3 供试品含量测定 将烘干至恒重的龙脷叶粉碎，过60 目筛，精密称取粉末0.5g，加入55%甲醇25mL，25℃条件下超声提取（功率250W，频率33kHz）40min，抽滤，取续滤液定容至50mL 容量瓶，即得供试品溶液。取适量，按照“2.2.1”系统条件下进样，记录峰面积，试验平行三次（n=3）。

2.2.4 稳定性分析 取江苏玄武样品，按照“2.2.3”方法下制备样品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h 时按照“2.2.1”系统条件下进样，得山奈酚-3-O-龙胆二糖苷峰面积RSD 为1.29%，样品溶液24h 内稳定性良好。

2.2.5 重复性分析 取江苏玄武样品6 份，按照“2.2.3”方法制备样品溶液，按照“2.2.1”系统条件进样，记录峰面积，得样品山奈酚-3-O-龙胆二糖苷平均含量为0.056%，RSD 为2.83%，方法重复性良好。

2.2.6 精密度分析 取山奈酚-3-O-龙胆二糖苷标准品溶液，按照“2.2.1”系统条件下连续进样6 次，记录峰面积，测得山奈酚-3-O-龙胆二糖苷峰面积RSD 为0.98%，仪器精密度良好。

2.2.7 加样回收率分析 精密称取已知含量的广东罗湖样品适量，分高、中、低三组，预设称样量分别为0.6、0.5、0.4g，加入山奈酚-3-O-龙胆二糖苷标准品适量，按照“2.2.3”方法下制备样品溶液，按照“2.2.1”系统条件下进样，记录峰面积，计算加样回收率=（测得量－原有量）/加入量×100%。见表2。

表2 加样回收率分析

2.3 统计学方法 生长性状与山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量比较采用SPSS 软件单因素方差ANOVA分析，聚类分析采取欧式距离，组间联接法[9]。

3 结果

3.1 生长性状分析 18 个产地龙脷叶生长性状存在差异（P＜0.05 或P＜0.01）。株高、枝条粗变幅分别为12.89～38.23cm、2.17～4.64mm，其中海南龙脷叶植株较为高大，海南儋州样品株高、枝条粗数值最大，分别达38.23cm 与4.64mm，海南万宁样品叶片最大，平均叶长与叶宽分别为15.81cm 与6.23cm；江苏龙脷叶植株相对较矮，其中江苏玄武样品株高与枝条粗分别为12.89cm 与2.17cm；叶型指数方面，广东罗湖龙脷叶叶片最为狭长，叶长宽比为2.67，江苏玄武叶片最为宽钝，叶长宽比为1.73，见表3。

3.2 山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量分析 供试龙脷叶样品中山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量存在差异（P＜0.01），平均含量0.061%，变幅0.036%～0.090%；云南样品含量较高，其次为上海、广西、福建、江苏样品，广东、海南样品含量较低，其中云南勐海样品含量最高，达0.090%，是其他样品的1.06～2.50 倍；18个产地龙脷叶山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量均满足2020 年版《中国药典》规定的不低于0.035%的标准（见表3），从山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量看，我国主分布区龙脷叶药材质量良好。

表3 18 个产地龙脷叶生长性状与山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量比较

3.3 相关性分析 18 个产地龙脷叶山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量与生长性状、生境因子关系密切，与经度、株高、枝条粗、叶长、叶宽、叶长宽比呈负相关关系，与纬度、海拔呈正相关关系，其中与叶长呈最大负相关，相关系数为0.7991，与海拔呈最大正相关，相关系数为0.6469（见表4）；相关性分析显示，从18个产地经纬度与海拔范围看，低经度、高纬度、高海拔地区种植龙脷叶，有利于其叶片中山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量积累。

表4 18 个产地龙脷叶山奈酚-3-O-龙胆二糖苷与生长性状、生境因子相关性分析

3.4 聚类分析 根据山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量与生长性状，按照欧氏距离D2=12.00 划分，可将18个产地分为3 大组，其中第1 组共4 个产地，分别为福建南靖、福建南安、江苏宜兴与江苏玄武，该组龙脷叶植株较矮，枝条细，叶片小而多宽钝，山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量中等大小；第2 组共7 个产地，包括云南屏边、云南勐海、广西青秀、广西钟山、广西兴宁、上海崇明与上海松江，该组龙脷叶植株矮，枝条细，叶片多小、宽钝，山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量较高；第3 组共7 个产地，包括海南儋州，海南万宁，广东罗湖，广东江门，广东鼎湖，广东顺德，广东天河，该组龙脷叶植株较高，枝条粗壮，叶片大而多狭长，山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量较低。见图2。

图2 基于欧式距离的18 个产地龙脷叶聚类分析图

4 讨论

龙脷叶在我国分布较广，南北跨度大。山奈酚-3-O-龙胆二糖苷是2020 年版《中国药典》规定的龙脷叶主要质量评价指标之一，具有抗炎、抑菌等活性[8]。本试验在收集全国主分布区龙脷叶种质资源的基础上，参考《中国药典》与已有龙脷叶含量测定文献[1，10-11]，优化了提取溶剂、超声时间及流动相，建立的HPLC 方法洗脱山奈酚-3-O-龙胆二糖苷理论塔板数大于3500，符合2020 年版《中国药典》规定的理论塔板数不低于3000 的要求[1]。科学的中药质量评价体系是保障中药国际化、产业化的关键，通过中药有效性—物质基础—质量控制关联链辨识质量标志成分，确定中药质量标志物（Quality marker，Qmarker）可以快速有效地对中药材进行质量评价[12]。山奈酚-3-O-龙胆二糖苷可作为龙脷叶药材的Qmarker，本文建立的HPLC 用于测定该Q-marker 操作步骤简便，方法重复性好，准确度高，可较为快速地评价龙脷叶药材质量。

供试龙脷叶样品中山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量存在差异（P＜0.01），18 份样品中，云南样品含量较高，其中云南勐海样品含量最高，达0.090%，其次为上海、广西、福建、江苏样品，广东、海南样品含量较低；生境因子（经纬度、海拔）、生长性状与山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量积累关系密切，从18 个产地经纬度与海拔范围看，低经度、高纬度、高海拔地区种植龙脷叶，有利于其叶片中山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量积累；以山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量为质量评价指标，高含量的龙脷叶药材应优先在低经度、高纬度、高海拔的云南产地中选择；从生长性状看，矮株、细枝、叶片宽钝的龙脷叶中，山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量相对较高，为后续龙脷叶优良品种选育提供参考依据。本试验将在高山奈酚-3-O-龙胆二糖苷含量的龙脷叶优良种质筛选的基础上，开展优良种质在区域（不同海拔）大田试验，以期选育出品质好，植株矮壮，叶片产量高的龙脷叶优良品系。此外，有学者报道龙脷叶中富含咖啡酸[13]、生物碱[14]、β-谷甾醇[15]等活性物质，在后续的质量评价体系建立中，应综合考虑上述化学成分。